les cours
Chapitre I Support de l'information génétique
Objectifs
- Expériences ayant conduit à la découverte de l'ADN comme matériel génétique.
- Composition chimique de l'ADN.
- Structure de l'ADN.
- Caractérisation et analyses de l'ADN.
1-Introduction
La variété des organismes vivants est extraordinaire, on estime qu'il ya de nos jours plus
de 10 millions d'espèces. Chaque espèce est différente des autres. Cette différence est due au contenu en information génétique de chaque espèce. Les généticiens ont envisagé que des molécules spécifiques étaient porteuses de cette information génétique. Les êtres vivants sont subdivisés en deux groupes: les eucaryotes et les procaryotes, se différencient par la présence ou non d'un noyau.
2-ADN comme matériel génétique
En 1869: Fredrich Micher utilisa une protéase (pepsine: découverte en 1836) pour séparer le noyau du cytoplasme. Il a observé une petite tache de poudre grise qui s'était détachée d'un liquide claire jaunâtre (cytoplasme). Il l'appela nucléine.
En 1889: Le biologiste Altman a précisé que la nucléine c'est un acide nucléique.
En 1928 : L’expérience de Griffith a montrée que la souche S tuée ne tue pas la souris, mais lorsqu'elle est mélangée avec la souche R vivante, la souris injectée meurt. Comme conclusion la souche R est transformée en souche S, et le facteur transformant est l'ADN.
En 1952-1953: - Franklin a obtenu une excellente photographie d'ADN par diffraction des rayons X.
- La même année Watson et Crick utilisant les données de Chargaff et l'image obtenue par Franklin ont établi le modèle de la double hélice (la forme B)
3-Composition chimique de l'ADN
Les travaux de Kornberg révélèrent que les précurseurs de l'ADN étaient des nucléotides riches en énergie (dNTP, dCTP, dTTP, dGTP). Chaque nucléotide est composé d'acide phosphoriques (3), base azotée (A, T, C, G) et un pentose(2'-désoxy-β-D-Ribose). La liaisonformée entre deux phosphates donne un anhydride avec une liaison très riche en énergie, et la liaison entre le groupement acide du phosphate et l'hydroxyle du sucre donne une liaison ester. La liaison formée entre le sucre et la base est une liaison osidique de type β-N-glycosidique
4-Structure de l'ADN
Les acides désoxyribonucléiques sont de très grandes molécules composées de deux chaines polynucléotidiques enroulées l'une autour de l'autre pour former une double hélice régulière (La forme B a un diamètre de 2,47 nm)
Fig : Structure détaillée de la double hélice de l'ADN (forme B). Un tour d'hélice recouvre environ 10.5 pb (34 Å). Le squelette de chaque brin est formé de sucre et de phosphate. Les bases azotées sont projetées vers l'intérieur de la molécule mais restent accessibles au solvant par les deux sillons (petit et grand sillon).
5-Interactions entre C-G et A-T
Deux types de paires de bases, souvent appelées paires de bases complémentairesprédominants dans la plupart des ADN A-T et C-G. Le paire de base A-T est associé par deux liaisons hydrogène et le G-C par trois.
5-1-Liaison hydrogène
Les liaisons hydrogène entre les bases complémentaires sont l'une des caractéristiques fondamentales de la double hélice, car elles assurent la stabilité thermodynamique de l'hélice et la spécificité de l'appariement. Une liaison hydrogène est formée entre un atome ou groupement donneur d'hydrogène chargé positivement et un autre accepteur chargé négativement .Dans l'ADN, les liaisons hydrogène stabilisent les paires de base de la double hélice. La complémentarité entre les bases repose sur des raisons stériques
L'appariement de base entre deux purines, deux pyrimidines ou des bases non complémentaires A-C ou G-T est défavorisé, parce que les liaisons hydrogènes appropriées ne peuvent se former sous peine de rompre la géométrie de l'hélice. Une conséquence de cette règle d'appariement des bases est que la séquence d'un brin définit la séquence des bases de l'autre brin.
5-2-Stabilisation de la double hélice de l'ADN
La stabilisation de la double hélice s'effectue par des liaisons chimiques faible et non covalentes à la fois internes et externes:
1- Liaisons hydrogène entre les bases.
2- Interactions hydrophobes et électroniques entre les bases
3- Interactions des groupements sucre et phosphate avec le milieu aqueux (interactions hydrophiles).
6-2-Formes de l'ADN
Dans l'espace les deux chaines présentent une configuration hélicoïdale. Elles s'enroulent autour d'un axe imaginaire pour constituer une double hélice à rotation droite (Ex. Forme A et B) ou bien a rotation gauche (Ex. Forme Z).Il existe plusieurs structures hélicoïdale de l'ADN jusqu'a maintenant présent, six formes ont été décrites (A E et Z), mais la plupart d'entre elles ont été trouvées dans des conditions expérimentales contrôlées.
Forme B
La forme B de l'ADN est la forme biologique la plus importante, elle correspond à la forme décrite par Watson et Crick en 1953. Cette forme est caractérisée par un pas (tour) d'hélice de 10.5 pb (34 Å) et un diamètre de 2,37nm . La forme B de l'ADN est caractérisée aussi par la présence de deux sillons, le petit sillon et le grand sillon
ADN forme B. Toutes les bases ont la même conformation par rapport à l'ose et sont à l'intérieur de l'hélice. Les groupements phosphate et les désoxyriboses sont à l'extérieur
7- Propriétés physico-chimiques de l'ADN
Les liaisons hydrogène et les interactions hydrophobes qui maintiennent la structure en double hélice sont des forces faibles et des quantités relativement petites d'énergie peuvent séparer les deux brins, un processus appelé dénaturation.
7-1- Température de fusion
Si une solution d'ADN est chauffée, à une certaine température, les liaisons hydrogène qui assurent la cohésion des 2 brins appariés se rompent. On parle de fusion de l'ADN caractérisée par la température de fusion (Tm : melting temperature) .La dénaturation et la renaturation des brins d'ADN en solution sont des reconstitutions critiques pour diverses fonctions biologiques normales (réplication; transcription …etc.).(Fig)
7-2- Facteurs influençant la Tm
La température de fusion est influencée par plusieurs facteurs :
- C + G % : la Tm augmente avec l'augmentation du% CG ; Pour les petites séquences comme les amorces (17 à 31) Tm= 4(C+G) + 2(A+T)
- Les cations (mono ou divalent).
- Les polyamines.
- Les protéines.
Fig. La séparation des brins d'ADN en fonction de la température. Tm est la température pour parvenir à 50% de séparation des deux brins. Il ya une augmentation de l'absorption à 260 nm. Les régions riches en A et T s'ouvrent plus rapidement à celles riches en C et G
7-3- Absorption de la lumière ultraviolette
La propriété d'absorption des purines et pyrimidines dans l'UV à 260nm, et les protéines à 280nm permet de doser les acides nucléiques (C: concentration), et aussi bien d'estimer la contamination par les protéines lors de la purification des acides nucléiques.
C = A260*DF*100 (unité: µg/µl A: Absorbance,DF: facteur de dilution)
P (pureté) = A260 /A280 (Une solution d'ADN est considérée pure si 1.7 ≤ P ≤ 2)
Chapitre II Expression de l'information génétique
Objectifs
- Rôle des éléments nécessaires (éléments cis, trans, protéines, enzymes…etc.) pour transcrire un gène.
- Etapes de la transcription et les facteurs impliqués.
- Différences entre la transcription chez les procaryotes et les eucaryotes.
- Maturation des ARNm chez les eucaryotes.
- Cadres de lecture ouvert (ORF) et Code génétique
- Eléments nécessaires (ARNs, protéines, enzymes) pour traduire un ARNm en polypeptide.
- Etapes de la traduction et les facteurs impliqués.
- Différences entre la traduction chez les procaryotes et les eucaryotes.
1-Transcription
La transcription est le premier processus de régulation utilisé par les cellules, tissus et organismes pour faciliter et contrôler les programmes complexes de l'expression génétique, le métabolisme cellulaire, et le développement des tissus et les organes. L'information génétique est stockée dans l'ADN. Cependant, l'expression de cette information génétique nécessite le passage de l'ADN à l'ARN, puis aux protéines (transcription, traduction). On appel transcription la synthèse de brin d'ARN dont la séquence est dictée par celle de la molécule d'ADN correspondante.
Les trois principaux types d'ARN connus sont:
- ARN messager (ARNm) : Spécifie les codons
- ARN de transfert (ARNt): Spécifie les anticodons
- ARN ribosomique (ARNr): Constituant de ribosomes et impliqué dans la synthèse des protéines.
Chez les procaryotes ces ARN sont synthétisées par une seule ARN polymérase. Chez les eucaryotes elles sont synthétisées par trois types de polymérases, ARN pol I, ARN poI II, et ARN pol III . La réaction nécessite un brin d'ADN qui sert de modèle, les nucléosides trois phosphate (ATP, GTP, CTP, UTP) et Mg++.
1-1- Gène : Le gène est l'unité fonctionnelle de l'information génétique. Il est constitué d'un ensemble de nucléotides qui contient toutes les informations nécessaires pour transcrire un ARNm .
ARNm: Une succession de nucléotides sous forme de long filament a un seul brin. C'est un vecteur du message dictant la séquence des protéines entre chaque gène et la protéine correspondante.
Promoteur: Site sur l'ADN d'une centaine de bases auquel l'ARN polymérase (ainsi que les facteurs d'initiation requis) se fixe pour commencer la transcription. Chez E. coli il ya environ 2000 sites promoteurs (4.8 x106pb), elles sont qualifiés d'éléments cis.
1-2-ARN polymérase
L'ARN polymérase assume de multiples fonctions dans le processus de la transcription:
- Elle cherche les promoteurs
- Elle déroule le fragment à transcrire pour produire une matrice simple brin
- Elle sélectionne les NTPs corrects et catalyse la formation des liaisons phosphodiester.
- Elle détecte les signaux de terminaison.
- Elle interagit avec les protéines de régulation de l'expression génétique (activateurs, répresseur).
Les ARN polymérases réalisent essentiellement les mêmes réactions dans toutes les cellules procaryotes et eucaryotes. Les bactéries possèdent une seule ARN polymérase (l'enzyme minimale) capable à elle seule de synthétiser de l'ARN, elle est composée de quatre sous unités, chacune codée par un gène différent. Elle comprend la sous-unité σ et deux sous- unité α et un exemplaire de chacune des sous-unités β, β'et une sous-unité ω (n'est pas essentielle à la transcription mais elle a un rôle dans la stabilisation du complexe). Parmi ces sous unités les polypeptides β, β' sont à l'origine de l'activité catalytique et constituent le site actif de la transcription, ce site ressemble à celui de l'ADN polymérase par le fait que sous sa forme active, il contient deux ions métalliques. La sous unité σ aide à trouver un site promoteur ou' doit commencer la transcription.
La transcription chez les procaryotes se fait au niveau du cytoplasme, elle est polycistronique car plusieurs gènes peuvent être transcrit par la même polymérase (Ex. L'opéron lactose). Par contre chez les eucaryotes, celle-ci se fait au niveau du noyau, et une polymérase transcrit un seul gène, on dit qu'elle est monocistronique
Fig.: Synthèse monocistronique (eucaryotes) et polycistronique (procaryotes) de l'ARNm
Chapitre IV
Techniques de Biologie moléculaire
L'étude des processus génétiques nécessite un grand nombre de techniques expérimentales. Cela consiste à utiliser des méthodes pour l'extraction, la purification, la séparation, restriction, l'amplification, le séquençage …etc.des acides nucléiques.
1- Extraction et purification des acides nucléiques
Toute étude de génétique moléculaire implique la disposition d'échantillon d'acides nucléiques.Les techniques d'extraction d'acides nucléiques sont relativement simples. Il convient simplement d'éviter toute destruction enzymatique ou mécanique. En effet les acides nucléiques qui sont stables dans la cellule intacte, deviennent très vulnérables à la digestion par les nucléases endogènes une fois la cellule lysée.
1-1- Source d’ADN à cloner
Un fragment d'ADN spécifique (Ex. gène) est récupéré par différents façon (PCR, RT-PCR, extraction...etc.) et de différentes sources (cellules nucléés, virus). La mappe au dessous montre les différents façons d’obtenir l’ADN, afin de l’utiliser dans le clonagemoléculaire
1-2- Préparation de l'ADN à partir du sang total
Les globules blancs (lymphocytes, macrophages…etc.) représentent la source majeured'ADN en médecine. A partir de 10 à 30 ml de sang en présence d'un anticoagulant (ex. EDTA), il est possible de récupérer une quantité d'ADN (≈100µg) suffisante, pour des études qualitatives et quantitatives.
1-2-1- Protocole expérimental
1- Prélèvement de 10 à 30 ml de sang dans un tube contenant un anticoagulant (ex. EDTA).
2- Éclatement des globules rouges par une solution hypotonique
3- Récupération des globules blancs par centrifugation.
4- Préparation du lysat cellulaire en utilisant la solution de lyse (détergent comme le SDS ou sarcosyl + Protéinase K). Cette étape permet la libération de l'ADN nucléaire dans le milieu et la digestion des protéines qui lui étaient associées.
5- Extraction phénolique : cette étape permet de récupérer l'ADN dans la phase aqueuse après la centrifugation, car le phénol est un déprotéinisant puissant dans lequel les acides nucléiques ne sont pas solubles.
6-Extraction au chloroforme ou à l'éther : cette étape complète toujours une extraction phénolique, car elle permet d'éliminer les traces de phénol qui aurait pu être importé par la phase aqueuse (le phénol peut inhiber les enzymes utilisées dans l'amplification, la
restriction…etc.).
7- Précipitation : cette étape permet la précipitation de l'ADN pour faciliter sa récupération. Il y’a deux types largement utilisés :
a-Précipitation à l'alcool éthylique : Elle doit être effectuée à haute force ionique (2.5 volumes d'éthanol 95° contre un volume d'échantillon). Pour les faibles concentrations, il faut prolonger le temps de précipitation (> 10h), comme il est possible d'accélérer la précipitation par le froid (-20°C à -70°C). L'ADN est récupéré par centrifugation.
b-Précipitation à l'isopropanol : Le principe est le même que la précipitation éthanolique. Ce type de précipitation se fait volume à volume. Mais deux caractéristiques majeures la différentient de la précipitation éthanolique. -Le sel n'est pas nécessaire- Les très petits fragments de DNA même à hautes concentrations ne sont pas précipités, ce qui permet de les éliminer.
8- Lavage : l'utilisation de l'éthanol 70° permet d'éliminer les sels, et les traces de l'isopropanol. L'ADN est récupéré par centrifugation.
9- Séchage: cette étape permet l'élimination de l'éthanol (s'évapore).
10- Resuspendre dans 10mM tris EDTA, l'eau purifiée de nucléases…etc.
1-2-2- Dosage des acides nucléiques
Les pyrimidines et les purines absorbent fortement les UV à 260nm.Une unité de densité optique à 260 nm correspond à:
- Une solution de DNA double brin à 50µg/ml
- Une solution de DNA simple brin ou RNA à 25µg/ml
C = A260* DF * 100
Ces valeurs s'appliquent à des acides nucléiques parfaitement purs et en solution homogène. Pour vérifier la pureté de l'ADN il faut calculer :
P (pureté)= A260 /A280
Une solution d'ADN est considérée pure si : 1.7 ≤ P ≤ 2
2--Electrophorèse
2-1- Introduction
Les plus grands progrès des dernières décennies en biologie moléculaire ont été obtenus par l'analyse et la manipulation des macromolécules, l'ADN en particulier. Bien que la séquence des acides nucléiques détermine ses fonctions biologiques, la longueur de ces polymères constitue leur propriété physique la plus utile.
Parmi les techniques les plus utilisées pour la séparation des acides nucléiques selon leur taille est l'électrophorèse.
2-2-Définition
C'est une technique de bioséparation permettant la séparation des biomolécules selon leur charge et leur taille (ADN, ARN, protéines). Le terme électrophorèse vient de : électroce qui signifie énergie électrique et de phoresis (photo en grec) qui veut dire porter, avoir en soi.
Les acides nucléiques en solution portent une charge négative à cause de l'ionisation de leurs groupements phosphate (macromolécules polyanioniques uniformément chargées). Ils se déplacent donc vers l'électrode (+). Toutes les séquences d'acides nucléiques ont un rapport charge/masse à peu près identique, quelle que soit leur longueur, parce que tous les nucléotides sont à peu prés de même masse (masse molaire moléculaire moyenne des nucléotides 330 g/mol).
Suivant les théories de l'électrophorèse la mobilité µ dans un champ électrique au sein d'un gel doué de pouvoir de filtration est:
Log µ= Logµo- Kr. C
Log µo: La mobilité de la molécule en milieu liquide C: Concentration du gel
Kr: Coefficient de retardement dû au gel (Lui même est en fonction de la masse moléculaire de la molécule).
Deux sortes de matrice de gel sont utilisées: l'agarose et le polyacrylamide.Le gel agit à la manière d'un tamis moléculaire au travers duquel les molécules d'ADN en mouvement doivent passer; les molécules de grande taille ont plus de difficulté pour passer à travers les mailles (pores) crées par le réseau des microfibres du gel et vont donc migrer plus lentement que les petites molécules. La vitesse de migration de l'ADN est influencée par deux paramètres :
- La masse moléculaire (nombre de pb)
- La concentration du gel (tab. 1).
Il faut noter que la nature et la concentration du support de l'électrophorèse sont en fonction de la taille des fragments à séparer.
Dans toutes les électrophorèses, des marqueurs de taille (ou de poids moléculaire) sont déposés et migrent parallèlement au DNA étudié.Une fois l'électrophorèse terminée, les molécules fluorophores, comme le bromure d'éthidium, qui se fixe à l'ADN en s'intercalant entre les bases. Les bondes d'ADN (regroupent toute les molécules d'ADN de taille identique) sont visualisées sous UV
2-3- Détermination de la taille des fragments
La mobilité relative est le rapport entre la distance de migration d'une bande et la distance de migration du front de migration.La droite log(nombre de kb) = f(mobilité relative), permet de déterminer la taille d'une molécule d'ADN inconnue
Exemples de marqueurs de taille
- Phage λ coupé par BstEII (0.128.45)
- Phage λ coupé par HindIII (0.1323.13)
- pBR322 coupé par BstNI (0.121.86)
- 100 pb Ladder (1001000)
Les topoisoméres d'ADN (ont la même taille, mais dont les degrés de liaison sont différents) migrent différemment
4--Réaction de Polymérisation en Chaîne "PCR"
La synthèse et le séquençage d’ADN ont permis l’émergence d’une méthode d’amplification de l’ADN appelée PCR (Polymerase Chain Reaction), à partir d’un gène (ou fragment) spécifique, de grand quantité d’ADN sont obtenues in vitro. L’ADN polymérase copiant jusqu'à un milliard de fois cette région cible « quantité suffisante pour être révélée ».
4-1-Historique
Cette méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtient pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993.
Aujourd’hui, ce procédé révolutionnaire couplé à l’utilisation d’une ADN polymérasethermorésistante permet d’obtenir, sans clonage, une amplification considérable d’un fragment donné d’ADN.
4-2- Etapes de PCR :
La dénaturation de la double hélice nécessite une haute température (autour de 95°C), donc l’enzyme utilisée doit être résistante aux hautes températures ou bien elle devait être ajoutée lors de chaque cycle. Ce problème a été résolu en utilisant une ADN polymérase
thermiquement stable d’une bactérie thermophile : Thermus aquaticus, isolée d’une source chaude. Cette enzyme nommée ADN Taq polymérase est stable à 95°C (tab. 2) et n’est pas affectée par l’étape de dénaturation. Avec l’utilisation du Taq polymérase, l’ADN étant copié à 72°C et non plus 37°C, son utilisation augmente la spécificité de la PCR. Car aux hauts températures l’hybridation non spécifique d’amorces à l’ADN non cible est rare. Les produits de l’ADN Taq polymérase sont donc plus homogènes que ceux obtenus avec l’ADN polymérase III d’E. coli. En résumé il y’a quatre étapes :
1- Dénaturation (autour de 95°C) : Sert à dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin.
2- Hybridation (autour de Th): Lors du refroidissement du mélange, les amorces étant en excès, la plupart des brins d’ADN cibles se fixent à celles et non entre eux.
3- Extension (72°C) : L’ADN polymérase « prolonge les amorces : côté 3’-OH libre » en utilisant les brins cibles comme matrice.
4- Après une période appropriée d’incubation, le mélange est chauffé de nouveau pour séparer les brins. Il est alors refroidi pour que les amorces s’hybrident aux régions complémentaires de l’ADN nouvellement synthétisé. Le processus complet est alors répété « cycle ».
L’ADN polymérase de l’hyper thermophile Pyrococcus furiosus (croissance optimale à 100°C, la bactérie a été isolée d’une source hydrothermale), appeler Pfu polymérase. C'est la meilleure polymérase thermostable pour la correction des erreurs de réplication(Fidélitéélevée) grâce à son activité auto-correctrice. Cette enzyme est très utilisée lorsqu’unehaute précision est requise.De plus elle est plus stable que la Taq polymérase.
4-3 Thermocycleur
Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler l’activité enzymatique. Pour effectuer ces transitions de températures, les microtubes contenant le mélange réactionnel sont placés dans un appareil programmable : un thermocycleur (fig. 7). Cet appareil permet d’exposer les tubes à des températures choisies et pour des durées déterminées par l’expérimentateur (effectuer automatiquement les cycles de chauffage) (fig. 8).
Le secret de la PCR est que le produit d’un cycle d’extension sert de matrice pour le suivant (fig. 8), ainsi la technique PCR est remarquable par le fait que l’ADN cible se double à chaque cycle. En pratique 20 à 40 cycles sont habituellement réalisés, ils génèrent 106à 109fois la séquence cible. « Elle repose sur la succession de plusieurs cycles » (fig.9).
La progression géométrique de raison 2 (tab. 3) permet d’établir une relation pour calculer le nombre des copies totale et cibles.
Fig.7:Réaction d’amplification d’ADN dans le thermocycleur et visualisation du produit de PCR par électrophorèse.
4-4-Applications et sensibilité de la PCR
La PCR est un outil puissant, facile d’utilisation, hautement efficace, extrêmement sensible et spécifique, lors de chaque cycle, la quantité d’ADN étant multiplié par deux (augmentation exponentielle).
La connaissance de séquence de bordures entourant un gène d’intérêt est importante, les produits d’amplification obtenus par PCR peuvent être utilisés pour le clonage et le séquençage de ces gènes, ou pour des études comparatives ou phylogénétiques. Dans ces deux derniers cas, les amorces sont spécifiques à des régions conservées d’un gène commun d’une grande variété d’organismes. Par Exemple : le gène qui code pour l’ARNr 16S a des régions hautement conservées encadrant une région hautement variables. La PCR est utilisée aussi dans :
La mutagénèse dirigée
- Les études paléontologiques (fossiles : momies, plantes, animaux, …etc.)
- Le diagnostique microbiologique
- Le diagnostique moléculaire des maladies génétiques et infectieuses (surtout les cancers et les microorganismes difficilement cultivés Ex. Bartonella, virus …etc.).
N.B.La présence d’un gène spécifique indique la présence vraie semblable de l’agent causative. Ainsi, la PCR évite de devoir cultiver l’organisme, une procédure souvent longue et onéreuse.
5- Séquençage
Le séquençage est une technique d'analyse de l'ADN, il permet de déterminer l'ordre des nucléotides. Actuellement la technique de séquençage repose majoritairement sur la méthode enzymatique de Sanger.
5-1- Méthode de Sanger
Cette méthode génère des fragments d'ADN terminés par l'une des quatre bases marquées au préalable, car l'élongation de la chaîne s'arrêtera après l'incorporation d'un didésoxynucléotide (ddNTP) . C'est le principe sur lequel baser cette méthode.
La méthode de Sanger permet de déterminer une séquence inconnue par l'intermédiaire d'une copie d'ADN simple brin. Réalisé grâce à l'ADN polymérase et une amorce spécifique.
Pour mieux comprendre le principe de séquençage, on utilise des ddNTP non marqués. Alors on utilise quatre tubes séparés contenant l'un des ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Chaque tube contient: ADN polymérase (Ex. Pfu Polymérase); amorce (F ou R), dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP); eau purifiée de nucléases (WFN), MgCl2et l'ADN à séquencer
La détermination de l'enchaînement des nucléotides dans un fragment d'ADN simple brin par la méthode de Sanger comporte deux étapes:
1- Synthèse du brin complémentaire d'un brin matrice à l'aide d'une polymérase à partir d'une amorce, en présence des 4 dNTPs et d'un ddNTP qui joue le rôle de terminateur de chaîne (absence de 3'-OH). Quatre réactions en parallèle sont nécessaires, chacune avec l'un des terminateurs présents en faible quantité.
2- Séparation par électrophorèse (PAGE) des fragments synthétisés, le nombre de ces fragments dépend du nombre de résidus nucléotidiques. Donc la position des terminateurs dans la séquence (fig. 10).
5-2- Marquage des produits d'extension
Dans le séquençage automatique, des marqueurs fluorescents sont utilisés, un marqueur différent pour chaque ddNTP (bleu, rouge, vert, orange...etc.). La polymérisation se fait dans un seul tube contenant le mélange réactionnel et les quatre ddNTPs.
5-3- Séquençage d'un produit de PCR
Avant de séquencer un produit de PCR il faut le purifier en éliminant les composants suivants:
- Les dNTPs (car le rapport dNTP/ddNTP est important)
- Les amorces (on besoin d'une seule amorce F ou R pour amplifier un seul brin)
- Les sels (pour éviter l'inhibition de la polymérase lors du séquençage)
- Les produits de PCR non spécifiques (pour éviter les chevauchements de séquences: séquence artefacts).Généralement on utilise des kits de purification permettant d'éliminer tous les composants non essentiels mêmes des produits non spécifiques < 100 pb par des colonnes de chromatographie (filtration sur gel). Mais les inconvénients de cette méthode qu'elle est relativement coûteuse et n'élimine pas les produit non-spécifique > 100pb.
S'il y’a des produits de PCR non spécifiques > 100 pb la purification se fait sur gel d'agarose (utilisant low melting agarose), seulement la bande spécifique qui est récupérée, puis purifiée et séquencée.Les inconvénients de la purification sur gel qu'elle est très longue, coûteuse et donne de faibles rendements et le risque des mutations lors de la révélation des bandes sous UV en utilisant un agent intercalent.
N.B.Il y’a des enzymes permettant d'éliminer les dNTPs (ex. phosphatase) et les amorces (Ex. nucléase agissant sur l'ADN simple brin). Mais le coût élevé limite leur utilisation.
-Hybridation des acides nucléiques
L'hybridation est une propriété fondamentale des acides nucléiques qui repose sur les règles de complémentarité. Il est possible d'apparier des brins d'ADN ou ARN avec des oligonucléotides qui reconnaissent spécifiquement des séquences sur les brins d'ADN de manière antiparallèle et complémentaire. Ces oligonucléotides sont appelés sondes nucléiques . Pour le cas de deux brins complémentaires de la même molécule d'ADN (brins homologues) on parle de renaturation (hybridation à 100%). Chaque 1% de non homologie diminue la température d'hybridation (Th) de 1°C.
L'hybridation moléculaire est utilisée surtout dans la détection de l'homologie entre les molécules d'ADN de sources différentes. La complémentarité dépendra de la spécificité et de la sensibilité.La Th est estimée en utilisant plusieurs formules, cela dépend de la:
- Longueur du fragment (nombres de nucléotides).
- Composition du milieu
- Mis-appariement
- Le contenu en C+G
3-1-Formules utilisées pour calculer la Th
Formule de Wallace: Tm = 4 (C+G) + 2(A+T) ; Th = Tm-5
La formule de Wallace permet de déduire la Th des petits oligonucléotides (Ex. Les amorces).Pour les oligonucléotides avec N < 100 nucléotides on utilise la formule suivante en tenant compte la concentration du sel, les mésappariements et la concentration de formamide:
Tm = 16.6log[Na+] + 0.41(%(C+G))+ 81.5-(675/N)-%mismatch- 0.65% de formamide
Dans les conditions réactionnelles standards la Tm pour les longs séquences (>100):
Tm = 69.3 + 0.41(%(C+G))
La formule globale:
Tm = 81.5 + 16.6log[sel] + 0.41[%(C+G)] - % mis-appariement – (500/N) – 0.65%(formamide).
3-2 Facteurs influençant l'hybridation
- La concentration de l'ADN et le temps d'hybridation
- La température d'hybridation
- La force ionique
- La complexité des séquences
3-3-Types d’hybridation
L'objectif de l'hybridation est la détection de la présence d'un acide nucléique d'uneséquence donnée par l’utilisation d’un fragment d’ADNcomplémentaire = sonde. Cela peut avoir lieu en solution ou sur support solide (immobilisation de la cible sur une membrane[nitrocellulose, nylon], sur verre, colonies bactériennes, chromosomes, plage de lyse...etc.).
3-3-1-Hybridation d’ADN sur support solide : Southern blot
La procédure de ce type d'hybridation est résumée en sept étapes
1– Extraction de l'ADN
2– Digestion enzymatique (par les enzymes de restriction)
3– Electrophorèse du produit de la digestion
4– Transfert sur membrane
5– Hybridationavec une sonde spécifique marquée.6– Lavages7– Révélation
On peut aussi révéler la présence des séquences spécifiques dans les ARN (Northern Blot) et des protéines (Western Blot) utilisant le même principe.