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3-3-2-Hybridation in situ sur chromosome
Cette technique permet de déterminer sur quel chromosome et dans quelle région se trouve le gène d'intérêt. Les chromosomes fixés sur lame sont hybridés avec une sonde marquée (H3). L'éxamination microscopique révèle les signaux positifs sous forme de grains noirs disposés sur le chromosome. Comme exemple d'application est la détection des gènes viraux intégrés dans les chromosomes. Examine
3-3-3-Hybridation sur colonie de bactéries, sur plage de lyse
Ce type d'hybridation permet la détection parmi un grand nombre de bactéries ou de Phages recombinants (plage de lyse) celle ou celui qui contient le fragment d'ADN cible. La réalisation de cette technique passe par les étapes suivantes:
- Culture pure sur boite de Petri (colonies ou plage de lyse)
- Transfert sur membrane de nylon ou de nitrocellulose
- Lyse alcaline des bactéries et dénaturation de l'ADN
- Fixation par la chaleur ou les UV
- Hybridation avec une sonde marquée
- Lavage
- Autoradiographie
- Localisation des clones d'intérêt.
Chapitre Hôtes de clonage
En biotechnologie, le génie génétique est utilisé à des fins commerciales comme pour la production de nouveaux vaccins, des grandes quantités de protéines valorisables, ou l’introduction de gènes spécifiques dans un organisme animal ou végétale. Dans chaque cas, le choix de l’hôte est essentiel puisqu’il nous orientera vers un type de vecteur adapté.
1- L'hôte idéal : Pour obtenir de grande quantité d’ADN cloné l’hôte idéal doit
- Se développer rapidement dans un milieu de culture peu onéreux.
- Être non pathogène.
- Être capable d’incorporer l’ADN.
- Être stable en culture
- Possède des enzymes appropriées pour la réplication du vecteur.
Les hôtes répondant à ces critères sont des microorganismes eucaryotes ou procaryotes dont les génomes sont bien connus car entièrement séquencés, génétiquement manipulables. Il faut noter que E. coli est l’organisme le plus utilisé en clonage moléculaire. Malgré que cette bactérie soit comptée parmi la flore normale de l’intestin de l’homme et les animaux, il est aussi un pathogène potentiel (surtout les souches sauvages). Et aussi la synthèse d’endotoxines (LPS) susceptible de contaminer les produits finis, cela constitue un problème potentiel notamment pour les produit pharmaceutiques administrés par voie intraveineuse.
Aussi le problème,que E. coli retiens des protéines extracellulaires dans son espace périplasmique, ce qui peut rendre l’isolement et la purification des protéines recombinantes difficiles et coûteuse.
Avec Bacillus subtilus l’inconvénient majeur reste la difficulté de maintenir la réplication plasmidique dans les sous cultures, ce qui engendre souvent la perte de l’ADN cloné.
Des vecteurs plasmidique et des YAC (Yeast Artificial Chromosome) ont été développés pour le clonage dans la levure Saccharomyces cerivisae. L’avantage que présente cet hôte est qu’il possède les ARN et les systèmes post traductionnels complexes nécessaire à la synthèse de produits de gènes d’organismes supérieurs. Les processus post traductionnels peuvent être à l’origine de problème de clonage.
La culture de cellules de mammifères présente un coût élevé et des difficultés de production à grande échelle. En plus le niveau d’expression des gènes clonés est souvent faible (aussi pour les insectes, plantes, etc.).
On dit dans les cas des bactéries transformation, le processus d’intégration de l’ADN étranger, mais pour les eucaryotes on dit la transfection. Car, la transformation des cellules de mammifère désigne habituellement la conversion en cellules malignes (tumorales, cancéreuses). L’exemple le plus connu de l’application de cette caractéristique en biotechnologie est la production des anticorps monoclonaux.
2- Méthodes d'introduction de l'ADN à cloner dans la cellule hôte
Il y’a plusieurs méthodes sont largement utilisées pour introduire l’ADN dans les cellules hôtes.
N.B. Chez les bactéries on peut transférer l'ADN à cloner par trois méthodes: la transformation, la transduction et la conjugaison (voir cours génétique microbienne).
2-1- Électroporation
Cette technique implique l’exposition de l’hôte à des décharges électriques afin d’ouvrir les pores (temporairement) dans la membrane par lesquels, l’ADN cloné, ajouté dans le milieu, peut pénétrer sans lyse des cellules
2-2- Un canon à Particules
La transfection des cellules cibles se fait par des billes métalliques (généralement de tungstène) recouvertes d’acides nucléiques, en perçant parois et membranes plasmiques sans provoquer de lyse cellulaire. Cette technique a été utilisée sur des levures, des algues, des cellules de plantes et même des mitochondries et chloroplastes. De plus contrairement à l’électroporation, cette technique peut être utilisée pour introduire de l’ADN dans des tissus intacts comme des graines de plantes.
2-3-Microinjection
Dans les cellules animales, l’ADN peut être injecté dans le noyau par microinjection
Chapitre Vecteurs de clonage
Un vecteur de clonage est un petit élément génétique à réplication autonome, utilisé pour produire de multitude de copie du gène d’intérêt. Ces vecteurs de clonage sont spécialement conçus pour permettre l’intégration de la portion d’ADN exogène dans un site spécifique sans que cela affecte sa propre réplication. Il existe plusieurs types de vecteurs pouvant introduire des molécules d’ADN recombinées dans les bactéries, les levures, les cellules végétales ou les cellules de mammifères et humaines.
1- Vecteurs bactériens
La bactérie E. coli est la bactérie la plus utilisée en clonage moléculaire, l'ADN recombinant peut être introduit sous forme de plasmides, Phages, phagmides, cosmides, BAC etc.
1-1- Plasmides
Les plasmides sont des petits éléments génétiques extra-chromosomiques doués de la réplication autonome, ce sont typiquement des molécules d'ADN double brin, circulaires, leur taille varie de 1 kb à deux ou trois centaines de kb (< 5% de la taille du chrom osome bactérien). Ils contiennent des gènes codants souvent pour des protéines qui donnent un ou des avantage(s) à la cellule hôte. Comme par exemple :
- Résistance aux antibiotiques
- Résistance aux métaux lourds
- Dégradation de composés aromatiques
- Production de toxines
- Production d'antibiotiques
- Induction des tumeurs chez les plantes
- Plasmides à petit nombre de copies.
- Plasmides à grand nombre de copies.
Il faut noter que des mutations dans les plasmides peuvent affecter le nombre de copies du plasmide par cellule, surtout celles qui touchent au répresseur. En absence de ce répresseur, le nombre de copies augmente jusqu'à ce que la machinerie cellulaire responsable de l a réplication soit saturée. On obtient la même chose par l’utilisation des antibiotiques interférant avec la synthèse des protéines. Par exemple le chloramphénicol (inhibe la synthèse du répresseur), le nombre peut atteigne plusieurs milliers.
Les plasmides naturels possèdent dans leur génomes un locus nommé "par" qui fonctionne à la façon de centromère des chromosomes eucaryotes, ce locus contrôle la répartition précise des plasmides parmi les cellules filles lors de la division cellulaire. Pour réduire la taille des plasmides qui servent de vecteurs de clonage, le locus "par" est très souvent éliminé. C'est notamment le cas du plasmide pBR322 et leurs dérivés.
Les plasmides sont de bons vecteurs de clonage chez les bactéries parce qu’ils se multiplient en nombre de copies important et qu’ils sont aisément purifiables. Les marqueurs de sélection (Ex. gènes de résistance aux antibiotiques) permettent l’identification des bactéries recombinantes (transformées) qu’ils les portent.
1-2-Bactériophage λ
Le bactériophage λ a été découvert par E.M. Lederberg en 1950. C'est un virus d’E. coli, l'ADN de ce phage est une molécule linéaire d'ADN double brin de 48 kb. A chaque extrémité 5' se trouve une région monocaténaire de 12 nucléotides, l'une complémentaire de l'autre et leur association donne une structure circulaire à l'ADN dans la cellule hôte. L'association de ces extrémités cohésive naturelles forme le site cos (fig.)[cos: Des éléments important pour la réplication et l'encapsidation de bactériophage λ].
Le bactériophage λ a donné naissance aux premiers vecteurs de types phagiques car:
- Ça biologie est bien connue
- La quantité d'ADN qu'il peut intégrer est plus importante que celle véhiculée par les vecteurs plasmidiques. Il est possible d'insérer jusqu'au 22kb, après élimination de la partie indispensable au cycle de vie du phage .
- La possibilité d'empaqueter in vitro l'ADN phagique nu recombinant dans les têtes de phage.
- Il a une capacité d'infection (transfection) de l'hôte très rapide.
- Le nombre de copies par cellule étant considérable.
- Le rendement de cette transfection est très supérieur à ce qui est obtenu lors de la transformation de la bactérie par les plasmides.
Principales étapes de la construction d'un vecteur phagique
1- Produire une grande quantité de phage, la purifier, puis en extraire son ADN génomique, qui sera digéré par une enzyme de restriction.
2- Hybrider les deux bras du phage avec le fragment d'ADN à cloner (ce dernier doit avoir une taille adéquate) puis souder par l'ADN ligase.
3- Procéder à l'encapsidation in vitro de l'ADN recombinant en ajoutant les protéines phagiques de tête et de la queue. Ces derniers ils vont s'auto assembler pour former les nouveaux virions recombinants infectieux.
4- Infecter des bactéries (cellules hôtes) et les étaler sur boite de Pétri, chaque plage de lyse correspond à un phage recombinant qui peut être récupéré.
5- Vérifier la présence d'un insert dans l'ADN recombinant par toute procédure appropriée (hybridation ADN-ADN, séquençage, test bleu-blanc etc.)
1-3-Bactériophage M13
Comme le bactériophage λ, le M13 est un petit virus d’E. coli (6.407 kb). L'ADN de ce phage est sous forme simple brin circulaire positif. Mais lors de la réplication un ADN négatif complémentaire est synthétisé, c'est la forme réplicative (replicative form) ou la forme intermédiaire. La forme réplicative présente toute les qualités des vecteurs plasmidiques. En plus cette forme sert de matrice à la synthèse d'ADN simple brin qui peut être encapsidé et par conséquent facilement isolable.
Le M13 à des dérivés contenant une partie du gène lacZ (peptide α), avec un polylinker (MCS: multiple cloning site) de 13 sites uniques de restriction (54 pb). Ce qui permet d'insérer des fragments d'ADN dans ces sites, et la sélection des colonies blanches sur des boites contenant l'analogue X-gal.
1-4-Cosmides
Les cosmides sont des vecteurs artificiels (≈ 5kb) constitués d'un plasmide classique auquel ont été ajoutées les séquences cos du phage λ. Ces vecteurs rassemble à la fois les propriétés intéressantes des plasmides comme :
- L'origine de réplication
- Gène de résistance à un antibiotique
Et celles du bactériophage - Encapsidation in vitro de grand fragment d'ADN.
N.B. Il faut insérer de 32 à 47 kb d'ADN étranger dans un vecteur de type cosmide pour qu'il soit encapsidé.
Après l'encapsidation in vitro, la particule virale formée peut infecter une cellule hôte appropriée. L'ADN du cosmide recombinant injecté se circularise à l'intérieur de la cellule comme un ADN de phage. Mais il se réplique comme un plasmide, sans exprimer les fonctions du phage.
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