les cours

Chapitre I  Support de l'information génétique

 

Objectifs

- Expériences ayant conduit à la découverte de l'ADN comme matériel génétique.

- Composition chimique de l'ADN.

- Structure de l'ADN.

- Caractérisation et analyses de l'ADN.

1-Introduction

La  variété  des organismes vivants est extraordinaire, on estime qu'il ya de nos jours plus

de 10 millions d'espèces. Chaque  espèce  est différente  des autres. Cette différence est due au contenu  en  information  génétique  de  chaque  espèce.  Les  généticiens  ont  envisagé  que  des molécules spécifiques étaient porteuses de cette information génétique. Les êtres vivants sont subdivisés en deux groupes: les eucaryotes et les procaryotes, se  différencient par la présence ou non d'un noyau.

2-ADN comme matériel génétique

En  1869:  Fredrich Micher  utilisa une  protéase  (pepsine: découverte  en  1836) pour  séparer  le noyau  du cytoplasme. Il a observé une petite tache de poudre grise  qui  s'était  détachée d'un liquide claire jaunâtre (cytoplasme). Il l'appela nucléine.

En 1889: Le biologiste Altman a précisé que la nucléine c'est un acide nucléique.

En 1928 :  L’expérience de Griffith a montrée que la souche S tuée ne tue pas la souris, mais lorsqu'elle est mélangée avec la souche R vivante, la souris injectée meurt. Comme conclusion la souche R est transformée en souche S, et le facteur transformant est l'ADN.

En  1952-1953:  -  Franklin  a  obtenu  une  excellente  photographie  d'ADN  par  diffraction  des rayons X.

-  La même année Watson et Crick utilisant les données de Chargaff et l'image obtenue par Franklin ont établi le modèle de la double hélice (la forme B)

3-Composition chimique de l'ADN

Les travaux de Kornberg révélèrent que les précurseurs de l'ADN étaient  des  nucléotides riches  en  énergie  (dNTP,  dCTP,  dTTP,  dGTP).  Chaque  nucléotide  est  composé  d'acide phosphoriques  (3),  base  azotée  (A,  T,  C,  G)  et  un  pentose(2'-désoxy-β-D-Ribose).  La  liaisonformée entre deux phosphates  donne un anhydride avec une liaison très riche en énergie, et la liaison entre le groupement acide du phosphate et l'hydroxyle du sucre donne une liaison ester. La liaison formée entre le sucre et la base est une liaison osidique de type  β-N-glycosidique

 

4-Structure de l'ADN

Les  acides  désoxyribonucléiques  sont  de  très  grandes  molécules  composées  de  deux chaines  polynucléotidiques  enroulées  l'une  autour  de  l'autre  pour  former  une  double  hélice régulière (La forme B a un diamètre de 2,47 nm)

 

Fig : Structure détaillée de la double hélice de l'ADN (forme B). Un tour d'hélice recouvre environ 10.5 pb (34 Å). Le squelette de chaque brin est formé de sucre et de phosphate. Les bases azotées  sont projetées  vers  l'intérieur  de  la  molécule  mais  restent  accessibles  au  solvant  par  les  deux  sillons (petit et grand sillon).

5-Interactions entre C-G et A-T

Deux  types  de  paires  de  bases,  souvent  appelées  paires  de  bases  complémentairesprédominants  dans la plupart des  ADN  A-T  et  C-G.  Le  paire de base A-T est  associé  par  deux liaisons hydrogène et le G-C par trois.

5-1-Liaison hydrogène

Les  liaisons  hydrogène  entre  les  bases  complémentaires  sont  l'une  des  caractéristiques fondamentales de la double hélice,  car elles  assurent  la stabilité thermodynamique de l'hélice et  la  spécificité  de  l'appariement.  Une  liaison  hydrogène  est  formée  entre  un  atome  ou groupement  donneur  d'hydrogène  chargé  positivement  et  un  autre  accepteur  chargé négativement  .Dans  l'ADN,  les  liaisons  hydrogène  stabilisent  les  paires  de  base  de  la double hélice. La complémentarité entre les bases repose sur des raisons stériques

L'appariement  de  base  entre  deux  purines,  deux  pyrimidines  ou  des  bases  non complémentaires A-C ou G-T est défavorisé, parce que  les liaisons hydrogènes appropriées ne peuvent se former sous peine de rompre la  géométrie  de l'hélice. Une conséquence de cette règle d'appariement des bases est que la séquence d'un brin définit la séquence des bases de l'autre brin.

5-2-Stabilisation de la double hélice de l'ADN

La  stabilisation  de  la  double  hélice  s'effectue  par  des  liaisons  chimiques  faible  et  non covalentes à la fois internes et externes:

1-      Liaisons hydrogène entre les bases.

2-       Interactions hydrophobes et électroniques entre les bases

3-      Interactions  des  groupements  sucre  et  phosphate  avec  le  milieu  aqueux  (interactions hydrophiles).

 

6-2-Formes de l'ADN

Dans l'espace les deux chaines présentent une configuration hélicoïdale. Elles s'enroulent autour d'un axe imaginaire pour constituer une  double hélice à rotation droite (Ex. Forme A et B)  ou  bien  a  rotation  gauche  (Ex.  Forme  Z).Il  existe  plusieurs  structures  hélicoïdale  de  l'ADN jusqu'a  maintenant  présent,  six  formes  ont été  décrites  (A    E et  Z), mais  la plupart d'entre elles ont été trouvées dans des conditions expérimentales contrôlées.

Forme B

La forme B de l'ADN est la forme biologique la plus importante, elle correspond à la forme décrite par Watson et Crick en 1953. Cette forme est caractérisée par un pas (tour) d'hélice de 10.5 pb (34 Å) et un diamètre de 2,37nm  . La forme B de l'ADN est caractérisée aussi par la présence de deux sillons, le petit sillon et le grand sillon

 

 

 

ADN forme B. Toutes  les bases ont la même conformation par rapport à l'ose et sont à l'intérieur de l'hélice. Les groupements phosphate et les désoxyriboses sont à l'extérieur

7- Propriétés physico-chimiques de l'ADN

Les liaisons hydrogène et les  interactions hydrophobes qui maintiennent la structure  en double  hélice  sont  des  forces faibles  et  des  quantités  relativement  petites  d'énergie  peuvent séparer les deux brins, un processus appelé dénaturation.

7-1- Température de fusion

Si  une  solution  d'ADN  est  chauffée,  à  une  certaine  température,  les  liaisons  hydrogène qui  assurent  la  cohésion  des  2  brins  appariés  se  rompent.  On  parle  de  fusion  de  l'ADN caractérisée par la température de fusion (Tm : melting temperature) .La  dénaturation et  la  renaturation  des  brins d'ADN en  solution  sont  des  reconstitutions critiques pour diverses fonctions biologiques normales (réplication; transcription …etc.).(Fig)

7-2- Facteurs influençant la Tm

La température de fusion est influencée par plusieurs facteurs :

-  C + G % : la Tm augmente avec l'augmentation du% CG ; Pour les petites séquences comme les amorces (17 à 31) Tm= 4(C+G) + 2(A+T)

-  Les cations (mono ou divalent).

-  Les polyamines.

-  Les protéines.

Fig.  La  séparation  des  brins  d'ADN  en  fonction  de  la  température.  Tm  est  la  température  pour parvenir à 50% de séparation des deux brins. Il ya une augmentation de l'absorption à 260 nm. Les régions riches en A et T s'ouvrent plus rapidement à celles riches en C et G

7-3- Absorption de la lumière ultraviolette

La propriété d'absorption des purines et pyrimidines dans l'UV à 260nm, et les protéines à 280nm permet de doser les acides nucléiques (C: concentration), et aussi bien d'estimer la contamination par les protéines lors de la purification des acides nucléiques.

C = A260*DF*100  (unité: µg/µl   A: Absorbance,DF: facteur de dilution)

P (pureté) = A260 /A280   (Une solution d'ADN est considérée pure si 1.7 ≤ P ≤ 2)

 

 

 

 

 

Chapitre II Expression de l'information génétique

 

Objectifs

-  Rôle des éléments nécessaires (éléments cis, trans, protéines, enzymes…etc.) pour transcrire un gène.

-  Etapes de la transcription et les facteurs impliqués.

-  Différences entre la transcription chez les procaryotes et les eucaryotes.

-  Maturation des ARNm chez les eucaryotes.

-  Cadres de lecture ouvert (ORF) et Code génétique

-  Eléments nécessaires (ARNs, protéines, enzymes) pour traduire un ARNm en polypeptide.

-  Etapes de la traduction et les facteurs impliqués.

-  Différences entre la traduction chez les procaryotes et les eucaryotes.

1-Transcription

La  transcription  est  le  premier  processus  de  régulation  utilisé  par  les  cellules,  tissus  et organismes pour faciliter et contrôler les programmes complexes de l'expression  génétique, le métabolisme cellulaire, et le développement  des tissus et les organes. L'information génétique est  stockée  dans  l'ADN.  Cependant,  l'expression  de  cette  information  génétique  nécessite  le passage de l'ADN à l'ARN, puis aux protéines (transcription, traduction). On appel transcription la  synthèse  de  brin  d'ARN  dont  la  séquence  est  dictée  par  celle  de  la  molécule  d'ADN correspondante.

Les trois principaux types d'ARN connus sont:

-  ARN messager (ARNm) : Spécifie les codons

-  ARN de transfert (ARNt): Spécifie les anticodons

-  ARN  ribosomique  (ARNr):  Constituant  de  ribosomes  et  impliqué  dans  la  synthèse  des protéines.

Chez les procaryotes ces ARN sont synthétisées par une seule ARN polymérase. Chez les eucaryotes elles sont synthétisées par trois types de polymérases, ARN pol  I, ARN poI  II, et ARN pol  III .                                   La  réaction  nécessite  un  brin  d'ADN  qui  sert  de  modèle,  les  nucléosides  trois phosphate (ATP, GTP, CTP, UTP) et Mg++.

1-1- Gène : Le  gène  est  l'unité  fonctionnelle  de  l'information  génétique.  Il  est  constitué  d'un ensemble  de  nucléotides  qui  contient  toutes  les  informations  nécessaires  pour  transcrire  un ARNm .

ARNm:  Une  succession  de  nucléotides  sous  forme  de  long  filament  a  un  seul  brin.  C'est  un vecteur  du  message  dictant  la  séquence  des  protéines  entre  chaque  gène  et  la  protéine correspondante.

Promoteur:  Site  sur  l'ADN  d'une  centaine  de  bases  auquel  l'ARN  polymérase  (ainsi  que  les facteurs d'initiation requis) se fixe pour commencer la transcription. Chez  E. coli  il ya environ 2000 sites promoteurs (4.8 x106pb), elles sont qualifiés d'éléments cis.

1-2-ARN polymérase

L'ARN polymérase assume de multiples fonctions dans le processus de la transcription:

-  Elle cherche les promoteurs

-  Elle déroule le fragment à transcrire pour produire une matrice simple brin

-  Elle sélectionne les NTPs corrects et catalyse la formation des liaisons phosphodiester.

-  Elle détecte les signaux de terminaison.

-  Elle  interagit  avec  les  protéines  de  régulation  de  l'expression  génétique  (activateurs, répresseur).

Les  ARN  polymérases  réalisent  essentiellement  les  mêmes  réactions  dans  toutes  les cellules  procaryotes  et  eucaryotes.  Les  bactéries  possèdent  une  seule  ARN  polymérase (l'enzyme minimale) capable à elle seule de synthétiser de l'ARN, elle est  composée de quatre sous  unités,  chacune  codée  par  un  gène  différent. Elle  comprend  la  sous-unité  σ  et deux sous-  unité α  et un exemplaire de  chacune  des sous-unités β, β'et une sous-unité ω (n'est pas essentielle à la transcription mais elle a un rôle dans la stabilisation du complexe). Parmi ces sous unités les polypeptides β, β' sont à l'origine de l'activité catalytique et constituent le site actif de la transcription, ce site ressemble à celui de l'ADN polymérase par le fait que sous sa forme active, il contient deux ions métalliques. La sous unité σ aide à trouver un site promoteur ou' doit commencer la transcription.

La  transcription  chez  les  procaryotes  se  fait  au  niveau  du  cytoplasme,  elle  est polycistronique  car  plusieurs  gènes  peuvent  être  transcrit  par  la  même  polymérase  (Ex. L'opéron  lactose).  Par  contre  chez  les  eucaryotes,  celle-ci  se  fait  au  niveau  du  noyau,  et  une polymérase transcrit un seul gène, on dit qu'elle est monocistronique

 

 

 

 

 

 

 

 

Fig.: Synthèse monocistronique (eucaryotes) et polycistronique (procaryotes) de l'ARNm

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Chapitre IV

Techniques de Biologie moléculaire

 

L'étude  des  processus  génétiques  nécessite  un  grand  nombre  de  techniques expérimentales.  Cela  consiste  à  utiliser  des  méthodes  pour  l'extraction,  la  purification,  la séparation, restriction, l'amplification, le séquençage …etc.des acides nucléiques.

1- Extraction et purification des acides nucléiques

Toute  étude  de  génétique  moléculaire  implique  la  disposition  d'échantillon  d'acides nucléiques.Les  techniques  d'extraction  d'acides  nucléiques  sont  relativement  simples.  Il convient simplement d'éviter toute destruction enzymatique ou mécanique.  En effet les acides nucléiques qui sont stables dans la cellule intacte, deviennent très vulnérables à la digestion par les nucléases endogènes une fois la cellule lysée.

1-1- Source d’ADN à cloner

Un fragment d'ADN spécifique (Ex. gène) est récupéré par  différents façon (PCR, RT-PCR, extraction...etc.)  et  de  différentes  sources  (cellules  nucléés,  virus).  La  mappe   au  dessous montre  les  différents  façons  d’obtenir  l’ADN,  afin  de  l’utiliser  dans  le  clonagemoléculaire

1-2- Préparation de l'ADN à partir du sang total

Les  globules  blancs  (lymphocytes,  macrophages…etc.)  représentent  la  source  majeured'ADN en médecine. A partir de 10 à 30 ml de sang en présence d'un anticoagulant (ex. EDTA), il est possible de récupérer une quantité d'ADN (≈100µg) suffisante, pour des études qualitatives et quantitatives.

1-2-1- Protocole expérimental

1- Prélèvement de 10 à 30 ml de sang dans un tube contenant un anticoagulant (ex. EDTA).

2- Éclatement des globules rouges par une solution hypotonique

3- Récupération des globules blancs par centrifugation.

4-  Préparation  du  lysat  cellulaire  en  utilisant  la  solution  de  lyse  (détergent  comme  le  SDS  ou sarcosyl + Protéinase K). Cette étape permet la libération de l'ADN nucléaire dans le milieu et la digestion des protéines qui lui étaient associées.

5-  Extraction phénolique : cette étape permet de récupérer l'ADN dans la  phase aqueuse après la  centrifugation,  car  le  phénol  est  un  déprotéinisant  puissant  dans  lequel  les  acides nucléiques ne sont pas solubles.

6-Extraction  au  chloroforme  ou  à  l'éther  :  cette  étape  complète  toujours  une  extraction phénolique, car elle permet  d'éliminer les traces de phénol qui aurait pu être importé par la phase  aqueuse  (le  phénol  peut  inhiber  les  enzymes  utilisées  dans  l'amplification,  la

restriction…etc.).

7-  Précipitation : cette étape permet la précipitation de l'ADN pour faciliter sa récupération. Il y’a deux types largement utilisés :

 a-Précipitation à l'alcool éthylique : Elle doit être effectuée à haute force ionique (2.5 volumes d'éthanol  95°  contre  un  volume  d'échantillon).  Pour  les  faibles  concentrations,  il  faut prolonger  le  temps  de  précipitation  (>  10h),  comme  il  est  possible  d'accélérer  la précipitation par le froid (-20°C à -70°C). L'ADN est récupéré par centrifugation.

b-Précipitation  à  l'isopropanol  :  Le  principe  est  le  même  que  la  précipitation  éthanolique.  Ce type  de  précipitation  se  fait  volume  à  volume.  Mais  deux  caractéristiques  majeures  la différentient de la précipitation éthanolique. -Le sel n'est pas nécessaire-  Les très petits fragments de DNA même à hautes concentrations ne sont pas précipités, ce qui permet de les éliminer.

8-  Lavage : l'utilisation de l'éthanol 70° permet d'éliminer les sels, et les traces de l'isopropanol. L'ADN est récupéré par centrifugation.

9-  Séchage: cette étape permet l'élimination de l'éthanol (s'évapore).

10- Resuspendre dans 10mM tris EDTA, l'eau purifiée de nucléases…etc.

1-2-2- Dosage des acides nucléiques

Les pyrimidines et les purines absorbent fortement les UV à 260nm.Une unité de densité optique à 260 nm correspond à:

- Une solution de DNA double brin à 50µg/ml

- Une solution de DNA simple brin ou RNA à 25µg/ml

C = A260* DF * 100

Ces  valeurs  s'appliquent  à  des  acides  nucléiques  parfaitement  purs  et  en  solution homogène. Pour vérifier la pureté de l'ADN il faut calculer :

P (pureté)= A260 /A280

Une solution d'ADN est considérée pure si : 1.7 ≤ P ≤ 2

2--Electrophorèse

2-1- Introduction

Les plus grands progrès des dernières décennies en biologie moléculaire ont été obtenus par l'analyse et la manipulation des macromolécules, l'ADN en particulier. Bien que la séquence des  acides  nucléiques  détermine  ses  fonctions  biologiques,  la  longueur  de  ces  polymères constitue leur propriété physique la plus utile.

Parmi les techniques les plus utilisées pour la séparation des acides nucléiques selon leur taille est l'électrophorèse.

2-2-Définition

C'est  une  technique  de  bioséparation  permettant  la  séparation  des  biomolécules  selon leur charge et leur taille (ADN, ARN, protéines). Le terme électrophorèse vient  de : électroce qui signifie  énergie électrique et de phoresis (photo en grec) qui veut dire porter, avoir en soi.

Les acides nucléiques en solution portent une charge négative à cause de l'ionisation de leurs groupements phosphate (macromolécules polyanioniques uniformément chargées). Ils se déplacent  donc  vers  l'électrode  (+).  Toutes  les  séquences  d'acides  nucléiques  ont  un  rapport charge/masse  à  peu  près  identique,  quelle  que  soit  leur  longueur,  parce  que  tous  les nucléotides  sont  à  peu  prés  de  même  masse  (masse  molaire  moléculaire  moyenne  des nucléotides 330 g/mol).

Suivant les théories  de l'électrophorèse la mobilité  µ  dans un champ électrique au sein d'un gel doué de pouvoir de filtration est:

Log µ= Logµo- Kr. C

Log µo: La mobilité de la molécule en milieu liquide        C: Concentration du gel

Kr: Coefficient de retardement dû au gel (Lui même est en fonction de la masse moléculaire de la molécule).

Deux sortes de matrice de gel sont utilisées: l'agarose et le polyacrylamide.Le gel agit à la manière d'un tamis moléculaire au travers duquel les molécules d'ADN en mouvement doivent passer;  les  molécules  de  grande  taille  ont  plus  de  difficulté  pour  passer  à  travers  les  mailles (pores) crées par le réseau des microfibres du gel et vont donc migrer plus lentement que les petites molécules. La vitesse de migration de l'ADN est influencée par deux paramètres :

- La masse moléculaire (nombre de pb)

- La concentration du gel (tab. 1).

Il  faut  noter  que  la  nature  et  la  concentration  du  support  de  l'électrophorèse  sont  en fonction de la taille des fragments à séparer.

Dans toutes les électrophorèses, des marqueurs de taille (ou de poids moléculaire) sont déposés  et  migrent  parallèlement  au  DNA  étudié.Une  fois  l'électrophorèse  terminée,  les molécules  fluorophores,  comme  le  bromure  d'éthidium,  qui  se  fixe  à  l'ADN  en  s'intercalant entre les bases. Les bondes d'ADN (regroupent toute les molécules d'ADN de taille identique) sont visualisées sous UV

 

2-3- Détermination de la taille des fragments

La  mobilité  relative  est  le  rapport  entre  la  distance  de  migration  d'une  bande  et  la distance  de  migration  du  front  de  migration.La  droite  log(nombre  de  kb)  =  f(mobilité  relative), permet de déterminer la taille d'une molécule d'ADN inconnue

Exemples de marqueurs de taille

-  Phage λ coupé par BstEII (0.128.45)

-  Phage λ coupé par HindIII (0.1323.13)

-  pBR322 coupé par BstNI (0.121.86)

-  100 pb Ladder (1001000)

Les  topoisoméres  d'ADN  (ont  la  même  taille,  mais  dont  les  degrés  de  liaison  sont différents) migrent différemment

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4--Réaction de Polymérisation en Chaîne "PCR"

La  synthèse  et  le  séquençage  d’ADN  ont  permis  l’émergence  d’une  méthode d’amplification  de  l’ADN  appelée  PCR  (Polymerase  Chain  Reaction),  à  partir  d’un  gène  (ou fragment)  spécifique,  de  grand  quantité  d’ADN  sont  obtenues  in  vitro.  L’ADN  polymérase copiant jusqu'à un milliard de fois cette région cible « quantité suffisante pour être révélée ».

4-1-Historique

Cette méthode de Biologie  Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtient pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993.

Aujourd’hui,  ce  procédé  révolutionnaire  couplé  à  l’utilisation  d’une  ADN  polymérasethermorésistante permet d’obtenir, sans clonage, une amplification considérable d’un fragment donné d’ADN.

4-2- Etapes de PCR :

La  dénaturation  de  la double  hélice nécessite  une haute température  (autour de  95°C), donc  l’enzyme  utilisée  doit  être  résistante  aux  hautes  températures  ou  bien  elle  devait  être ajoutée  lors  de  chaque  cycle.  Ce  problème  a  été  résolu  en  utilisant  une  ADN  polymérase

thermiquement  stable  d’une  bactérie  thermophile :  Thermus  aquaticus,  isolée  d’une  source chaude.  Cette  enzyme  nommée  ADN  Taq  polymérase  est  stable  à  95°C  (tab.  2)  et  n’est  pas affectée par l’étape de dénaturation. Avec l’utilisation du Taq polymérase, l’ADN étant copié à 72°C   et  non  plus  37°C,  son  utilisation  augmente  la  spécificité  de  la  PCR.  Car  aux  hauts températures l’hybridation non spécifique d’amorces à l’ADN  non cible est rare. Les produits de l’ADN Taq polymérase sont donc plus homogènes   que ceux obtenus avec l’ADN polymérase III d’E. coli. En résumé il y’a quatre étapes :

1-  Dénaturation (autour de 95°C) : Sert à dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin.

2-  Hybridation  (autour  de  Th):  Lors  du  refroidissement  du  mélange,  les  amorces  étant  en  excès,  la plupart des brins d’ADN cibles se fixent à celles et non entre eux.

3-  Extension  (72°C) : L’ADN polymérase « prolonge les amorces : côté 3’-OH libre » en utilisant les brins cibles comme matrice.

4-  Après une période appropriée d’incubation, le mélange est chauffé de nouveau pour séparer les brins. Il est alors refroidi pour que les amorces s’hybrident aux régions complémentaires de l’ADN nouvellement synthétisé. Le processus complet est alors répété « cycle ».

L’ADN  polymérase  de  l’hyper  thermophile  Pyrococcus  furiosus  (croissance  optimale  à 100°C, la bactérie a été isolée d’une source hydrothermale), appeler Pfu polymérase. C'est la meilleure  polymérase  thermostable  pour  la  correction  des  erreurs  de  réplication(Fidélitéélevée) grâce  à  son activité auto-correctrice. Cette enzyme est très utilisée  lorsqu’unehaute précision est requise.De plus elle est plus stable que la Taq polymérase.

4-3 Thermocycleur

Les  trois  étapes,  constituant  un  cycle  de  PCR,  sont  effectuées  à  des  températures différentes permettant  de  contrôler  l’activité  enzymatique.  Pour  effectuer  ces  transitions  de températures, les  microtubes  contenant  le  mélange  réactionnel  sont  placés  dans  un  appareil programmable :  un  thermocycleur  (fig.  7).  Cet  appareil  permet  d’exposer  les  tubes  à  des températures  choisies  et  pour  des  durées  déterminées  par  l’expérimentateur  (effectuer automatiquement les cycles de chauffage) (fig. 8).

Le  secret  de  la  PCR  est  que  le  produit  d’un  cycle  d’extension  sert  de  matrice  pour  le suivant (fig. 8), ainsi la technique PCR est remarquable par le fait que l’ADN cible se double à chaque cycle. En pratique 20 à 40 cycles sont habituellement réalisés, ils génèrent 106à 109fois la séquence cible. « Elle repose sur la succession de plusieurs cycles » (fig.9).

La  progression  géométrique  de  raison  2  (tab.  3)  permet  d’établir  une  relation  pour calculer le nombre des copies totale et cibles.

 

Fig.7:Réaction  d’amplification  d’ADN  dans  le thermocycleur  et  visualisation  du  produit  de  PCR par électrophorèse.

 

 

 

4-4-Applications et sensibilité de la PCR

La  PCR  est  un  outil  puissant,  facile  d’utilisation,  hautement  efficace,  extrêmement  sensible  et spécifique,  lors  de  chaque  cycle,  la  quantité  d’ADN   étant  multiplié  par  deux  (augmentation exponentielle).

La  connaissance  de  séquence  de  bordures  entourant  un  gène  d’intérêt  est  importante,  les produits d’amplification obtenus par PCR peuvent être utilisés pour le clonage et le séquençage de ces gènes, ou pour des études comparatives ou phylogénétiques. Dans ces deux derniers cas, les amorces sont spécifiques à des régions conservées d’un gène commun d’une grande variété d’organismes. Par Exemple : le gène qui code pour l’ARNr 16S a des régions hautement conservées encadrant une région hautement variables. La PCR est utilisée aussi dans :

  La mutagénèse dirigée

-  Les études paléontologiques (fossiles : momies, plantes, animaux, …etc.)

-  Le diagnostique microbiologique

-  Le  diagnostique  moléculaire  des  maladies  génétiques  et  infectieuses  (surtout  les  cancers  et  les microorganismes difficilement cultivés Ex. Bartonella, virus …etc.).

N.B.La présence d’un gène spécifique indique la présence vraie semblable de l’agent causative. Ainsi, la PCR évite de devoir cultiver l’organisme, une procédure souvent longue et onéreuse.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5-  Séquençage

Le  séquençage  est  une  technique  d'analyse  de  l'ADN,  il  permet  de  déterminer  l'ordre  des nucléotides.  Actuellement  la  technique  de  séquençage  repose  majoritairement  sur  la  méthode enzymatique de Sanger.

5-1-  Méthode de Sanger

Cette  méthode  génère  des  fragments  d'ADN  terminés  par  l'une  des  quatre  bases  marquées  au préalable, car l'élongation de la chaîne s'arrêtera après l'incorporation d'un didésoxynucléotide (ddNTP) . C'est le principe sur lequel baser cette méthode.

La méthode de Sanger permet de déterminer une séquence inconnue par l'intermédiaire d'une  copie  d'ADN  simple  brin.  Réalisé  grâce  à  l'ADN  polymérase  et  une  amorce  spécifique.

Pour mieux comprendre le principe de séquençage, on utilise des ddNTP non marqués. Alors on utilise quatre tubes séparés contenant l'un  des ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Chaque tube  contient:  ADN  polymérase  (Ex.  Pfu  Polymérase);  amorce  (F  ou  R),  dNTPs  (dATP,  dTTP, dCTP, dGTP); eau purifiée de nucléases (WFN), MgCl2et l'ADN à séquencer

 

 

 

 

 

 

 

La détermination de l'enchaînement des nucléotides dans un fragment d'ADN simple brin par la méthode de Sanger comporte deux étapes:

1-  Synthèse du brin complémentaire d'un brin matrice à l'aide d'une polymérase à partir d'une amorce, en présence des 4 dNTPs et d'un ddNTP qui joue le rôle de terminateur de chaîne (absence de 3'-OH). Quatre réactions en parallèle sont nécessaires, chacune avec l'un des terminateurs présents en faible quantité.

2-  Séparation par électrophorèse (PAGE) des fragments synthétisés, le nombre de ces fragments dépend du nombre de résidus nucléotidiques. Donc la position des terminateurs dans la séquence (fig. 10).

5-2- Marquage des produits d'extension

Dans le séquençage automatique, des marqueurs fluorescents sont utilisés, un marqueur différent pour chaque ddNTP (bleu, rouge, vert, orange...etc.). La polymérisation se fait dans un seul tube contenant le mélange réactionnel et les quatre ddNTPs.

5-3- Séquençage d'un produit de PCR

Avant de séquencer un produit de PCR il faut le purifier en éliminant les composants suivants:

- Les dNTPs (car le rapport dNTP/ddNTP est important)

- Les amorces (on besoin d'une seule amorce F ou R pour amplifier un seul brin)

- Les sels (pour éviter l'inhibition de la polymérase lors du séquençage)

- Les produits de PCR non spécifiques (pour éviter les chevauchements de séquences: séquence artefacts).Généralement  on  utilise  des  kits  de  purification  permettant  d'éliminer  tous  les composants non essentiels mêmes des produits non spécifiques < 100 pb par des colonnes de chromatographie  (filtration  sur  gel).  Mais  les  inconvénients  de  cette  méthode  qu'elle  est relativement coûteuse et n'élimine pas les produit non-spécifique > 100pb.

S'il  y’a  des  produits  de  PCR  non  spécifiques  >  100  pb  la  purification  se  fait  sur  gel d'agarose (utilisant low melting agarose), seulement la bande spécifique qui est récupérée, puis purifiée  et  séquencée.Les  inconvénients  de  la  purification  sur  gel  qu'elle  est  très  longue, coûteuse et donne de faibles rendements et le risque des mutations lors de la révélation des bandes sous UV en utilisant un agent intercalent.

N.B.Il  y’a  des enzymes permettant d'éliminer les dNTPs (ex. phosphatase) et les amorces (Ex. nucléase agissant sur l'ADN simple brin). Mais le coût élevé limite leur utilisation.

 

 

 

 

 

-Hybridation des acides nucléiques

 

L'hybridation  est  une  propriété  fondamentale  des  acides  nucléiques  qui  repose  sur  les règles  de  complémentarité.  Il  est  possible  d'apparier  des  brins  d'ADN  ou  ARN  avec  des oligonucléotides  qui  reconnaissent  spécifiquement  des  séquences  sur  les  brins  d'ADN  de manière antiparallèle  et complémentaire. Ces oligonucléotides sont appelés sondes nucléiques .  Pour  le  cas  de  deux  brins  complémentaires  de  la  même  molécule  d'ADN  (brins homologues)  on  parle  de  renaturation  (hybridation  à  100%).  Chaque  1%  de  non  homologie diminue la température d'hybridation (Th) de 1°C.

L'hybridation moléculaire est utilisée surtout dans la détection de l'homologie entre les molécules d'ADN de sources différentes. La complémentarité dépendra de la spécificité et de la sensibilité.La Th est estimée en utilisant plusieurs formules, cela dépend de la:

-  Longueur du fragment (nombres de nucléotides).

-  Composition du milieu

-  Mis-appariement

-  Le contenu en C+G

3-1-Formules utilisées pour calculer la Th

Formule de Wallace: Tm = 4 (C+G) + 2(A+T) ; Th = Tm-5

La  formule  de  Wallace  permet  de  déduire  la  Th  des  petits  oligonucléotides  (Ex.  Les amorces).Pour  les  oligonucléotides  avec  N  <  100  nucléotides  on  utilise  la  formule  suivante  en tenant compte la concentration du sel, les mésappariements et la concentration de formamide:

Tm = 16.6log[Na+] + 0.41(%(C+G))+ 81.5-(675/N)-%mismatch- 0.65% de formamide

Dans les conditions réactionnelles standards la Tm pour les longs séquences (>100):

Tm = 69.3 + 0.41(%(C+G))

La formule globale:

Tm = 81.5 + 16.6log[sel] + 0.41[%(C+G)] - % mis-appariement – (500/N) – 0.65%(formamide).

3-2 Facteurs influençant l'hybridation

- La concentration de l'ADN et le temps d'hybridation

- La température d'hybridation

- La force ionique

- La complexité des séquences

3-3-Types d’hybridation

L'objectif  de  l'hybridation  est  la  détection  de  la  présence  d'un  acide  nucléique d'uneséquence  donnée  par  l’utilisation  d’un  fragment  d’ADNcomplémentaire  =  sonde.  Cela peut  avoir  lieu  en  solution  ou  sur  support  solide  (immobilisation  de  la  cible  sur  une membrane[nitrocellulose, nylon], sur verre, colonies bactériennes, chromosomes, plage de lyse...etc.).

3-3-1-Hybridation d’ADN sur support solide : Southern blot

La procédure de ce type d'hybridation est résumée en sept étapes

1– Extraction de l'ADN

2– Digestion enzymatique (par les enzymes de restriction)

3– Electrophorèse du produit de la digestion

4– Transfert sur membrane

5–  Hybridationavec une sonde spécifique marquée.6–  Lavages7–  Révélation

On peut aussi révéler la présence des séquences spécifiques dans les ARN (Northern Blot) et des protéines (Western Blot) utilisant le même principe.