Topic outline
- General
- Microbiologie Industrielle.
Microbiologie Industrielle.
Flores utiles en microbiologie industrielle
1. Etude des souches et des levains
Principaux microorganismes utilisés
Bactéries lactiques
Les bactéries lactiques se caractérisent par la capacité de fermenter les glucides en acide lactique, un acide faible, favorable à la conservation des aliments. Depuis des temps lointains et longtemps de manière inexpliquée, les bactéries lactiques occupent une place importante dans le secteur agroalimentaire (industrie laitière, charcuterie, œnologie…). De nos jours, les professionnels de la fermentation maîtrisent la complexité des phénomènes fermentaires. Par voie de fermentation, les bactéries confèreront à un produit alimentaire donné des propriétés organoleptiques ou de conservation recherchées.
Figure 1 : exemple d’association de microorganismes (fabrication des charcuteries)
Les bactéries lactiques sont également reconnues pour améliorer l'équilibre de la flore intestinale chez l’homme et l’animal. Les probiotiques sont des produits à base de microorganismes vivants qui, ingérés en quantités déterminées engendrent un effet bénéfique pour l’hôte.
Les bactéries lactiques produisent une grande variété de peptides ayant une activité antibactérienne. Ces molécules appelées bactériocines sont utilisées pour assurer la sécurité sanitaire des produits laitiers. La nisine, par exemple, est une bactériocine produite par des souches de Lactococcus. Elle permet de lutter contre le gonflement butyrique des fromages fondus et pour inhiber la croissance de germes pathogènes comme Listeria monocytogenes ou Staphylococcus aureus dans certains fromages (des camemberts ont été fabriqués avec des souches produisant de la nisine)..
Les fermentations lactiques peuvent être gravement perturbées par des virus bactériens : les phages. Ces virus pénètrent dans les cellules, s'y multiplient et provoquent finalement leur lyse. Les phages libérés vont alors infecter de nouvelles bactéries. Ces phages lytiques se répandent rapidement et envahissent les ateliers de fabrication ou les préparations de levains
Les bactéries lactiques appartiennent aux taxons suivants :
Domaine
Bacteria
Phylum
Firmicutes
Classe
Bacilli
Ordre
Lactobacillales
Familles
Lactobacillaceae
Aerococcaceae
Leuconostoccaceae
Genres
Lactobacillus
Pediococcus
Aerococcus
Abiotrophia
Leuconostoc
Oenococcus
Espèces
Lactobacillus delbrueckii
Lactobacillus casei
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus sakei
Lactobacillus salivarius
Pediococcus acidilactici
Aerococcus vridans
Leuconostoc mesenteroides
Oenococcus oeni
Sous espèces
L. delbrueckii subsp. delbrueckii
L. delbrueckii subsp. bulgaricus
L. mesenteroides subsp. mesenteroides
L. mesenteroides subsp. cremoris
Familles
Streptococcaceae
Genres
Streptococcus
Lactococcus
Espèces
Streptococcus thermophilus
Lactococcus lactis
Lactococcus plantarum
Sous espèces
L. lactis subsp. lactis
L. lactis subsp. cremoris
Bactéries acétiques
Présentes naturellement sur les fruits, dans l'air, dans le vin, les bactéries acétiques appartiennent, en majorité, au genre Acetobacter. Gluconobacter est présente sur les fruits et dans les vins pendant la fermentation alcoolique seulement; elle a disparu des vins finis. Ces bactéries oxydent l’éthanol en acide éthanoïque. Elles interviennent notamment lors de la fabrication du vinaigre. L'acétification se déroule en aérobiose et aux alentours de 25°C.
Domaine
Bacteria
Phylum
Protebacteria
Classe
Alphaproteobacteria
Ordre
Rhodospirillales
Famille
Acetobacteraceae
Genres
Acetobacter
Gluconobacter
Espèces
Acetobacter aceti
Gluconobacter oxydans
Actinomycètes
Les Streptomyces sont des eubactéries filamenteuses, Gram-positives vivant dans le sol. Ce genre bactérien est caractérisé par une morphologie proche de celle des champignons filamenteux (production de spores de dissémination). Il s’agit du genre microbien le plus riche en producteurs de métabolites secondaires (antibiotiques, antifongiques, antitumoraux, insecticides).
Figure 3 : colonies de Streptomyces
Figure 4 : spores de Streptomyces
Levures
Si l'utilisation des levures pour la panification et la vinification est connue depuis l'époque préhistorique, la compréhension des mécanismes en jeu date des travaux de Pasteur au XIXe siècle. Les connaissances scientifiques et techniques ainsi acquises ont permis de cultiver de grandes quantités de levures dans des procédés de fermentation industrielle. Elles sont aujourd’hui utilisées pour la production de vitamines, d’enzymes, de biocarburants…
Certaines souches de Saccharomyces cerevisiae renferment dans leur cytoplasme deux virus à ARN. Le matériel génétique de l’un d’entre eux code une toxine exocellulaire capable de tuer d'autres levures et une protéine de résistance à cette même toxine. Ces levures sont appelées « levures killer ». Le second virus est nécessaire à la multiplication et au maintien du premier dans le cytoplasme.
Domaine
Eucarya
Phylum
Mycota (Fungi)
Classes
Ascomycota
Basidiomycota
Fungi imperfecti
Ordres
Saccharomycetales ?
Cryptococcales ?
Familles
Saccharomycetaceae
Cryptococcaceae
Genres
Saccharomyces
Kluyveromyces
Hansenula, Kloeckera
Schizosaccharomyces
Pas d’intérêt alimentaire
ou industriel.
Candida
Torulopsis
Brettanomyces
Rhodotorula
Moisissures
Les moisissures sont connues principalement en tant qu’agents responsables de l’altération des aliments. Elles sont cependant utiles pour la production d’antibiotiques (Penicillium chrysogenum, Cephalosporium acremonium), d’enzymes (Aspergillus niger), d’acide citrique (Aspergillus niger), de protéines alimentaires (Fusarium graminearum). Elles interviennent également dans diverses fabrications (fromages).
Domaine
Eucarya
Phylum
Mycota (Fungi)
Classes
Zygomycota
Ascomycota
Fungi imperfecti
Ordres
Mucorales
?
Moniliales
Genres
Mucor
Neurospora
Penicillium
Cephalosoporium
Aspergillus
Fusarium
Sélection
Les premières souches utilisées en microbiologie industrielle avaient pour origine le sol, l’eau, les aliments avariés… L’utilisation industrielle des microorganismes exige l’obtention de souches pures. Chacune de ces souches est donc isolée sur milieu solide puis caractérisée. Les caractères morphologiques, culturaux, biochimiques, antigéniques, lysotypiques et moléculaires sont confirmés suite à des réisolements successifs. Une fois qu’un microorganisme convenable est sélectionné, il est cultivé de façon à assurer la production des métabolites désirés.
Amélioration
Dès la découverte d’une souche prometteuse, on utilise pour l’améliorer des techniques de mutagenèse chimique ou physique (ultra-violets). Par exemple, les premières cultures de Penicillium notatum ne produisaient que de faibles quantités de pénicilline, en culture statique. En 1943, on isola une souche de Penicillium chrysogenum qui après plusieurs améliorations, présente un rendement 55 fois supérieur à la culture originale, la production ayant lieu dans de grands fermenteurs à agitation rotative.
La fusion de protoplastes permet l’obtention de cellules hybrides. Les protoplastes sont obtenus par hydrolyse (ou inhibition de la synthèse) de la paroi dans une solution isotonique. Le polyéthylène glycol provoque une solubilisation partielle des membranes cellulaires, permettant d’obtenir une fusion des cellules. Un hybride peut être intéressant s’il est issu de la fusion de deux cellules provenant de deux espèces différentes de potentialités complémentaires.
Actuellement, l’utilisation des techniques de l’ADN recombinant permettent d’améliorer les souches productrices de façon beaucoup plus ciblée.
Conservation
Lorsqu’un microorganisme a été sélectionné pour une production particulière, sa stabilité génétique devient prépondérante : les caractéristiques de la souche initiale doivent être maintenues.
Transfert périodique
Le repiquage régulier d’une souche microbienne sur un milieu de culture est la méthode la plus simple mais elle entraîne parfois une perte des caractères initiaux. Par exemple, Streptomyces griseus perd la moitié de sa capacité à produire de la streptomycine au bout de quatre repiquages successifs. La fréquence du repiquage, le milieu utilisé et la température de stockage sont des variables importantes. Des géloses profondes (pauvres) pour conservation sont également commercialisées. Pour les bactéries sporogènes (Bacillus), les suspensions de spores peuvent être conservées à 4°C.
Congélation
Les microorganismes sont généralement revivifiables après congélation. Pour maintenir les structures cellulaires intactes, il convient d’abaisser rapidement la température jusqu’à –80°C (ou –196°C dans l’azote liquide) en présence d’une substance cryoprotectrice (glycérol à 20 %, diméthylsulfoxyde). Les bactéries lactiques par exemple, peuvent être congelées dans du lait ; les spores non thermorésistantes des Streptomyces sont conservées à –20°C dans une solution de glycérol.
Dessiccation
Les microorganismes, déposés sur des disques de papier filtre stériles ou inclus dans des gouttes de gélatine, sont soumis à de la chaleur sèche ou à de l’anhydride phosphorique. La lyophilisation est une dessiccation sous vide : après congélation, l’abaissement de la pression entraîne une sublimation de la glace. Des agents cryoprotecteurs sont également utilisés.
2. Production des souches et des levains
Les étapes de la production
Revivification
Les souches lyophilisées sont fournies dans des ampoules (figure 6) ou des flacons (figure 7). Elles sont revivifiées de la façon suivante :
Incuber dans les conditions spécifiées de température et d'atmosphère.
Incuber dans les conditions spécifiées de température et d'atmosphère.
Préculture
Une préculture de la souche microbienne productrice est réalisée en plusieurs exemplaires à partir du stock conservé selon les méthodes précédemment décrites. Le milieu de préculture est identique au milieu de culture en fermenteur. Le volume de milieu est compris entre 1/20e et 1/10e du volume de milieu présent dans le fermenteur (par exemple : 500 mL à 1 L de préculture pour un fermenteur de 10 L). Des contrôles sont effectués sur cette préculture afin d’éviter la contamination de l’unité de production.
Contrôles
La pureté d’une souche microbienne constitue la première condition d’un manipulation en microbiologie. Le contrôle de pureté comporte :
- un examen microscopique après coloration,
- une purification sur gélose adaptée à la souche.
Le contrôle de stérilité est la vérification de l’absence de microorganisme dans un milieu non ensemencé. Au laboratoire, il s’agit de placer aux températures habituelles d’incubation des milieux solides ou liquides pendant 48 heures, afin de déceler la présence d’éventuels contaminant susceptibles de perturber la production.
Production en fermenteur (voir cours de STBI : fermentation)
Dans les systèmes de fermentation en phase liquide, trois procédés peuvent être utilisés :
- culture discontinue (« batch ») : volume constant, pas de renouvellement du milieu ;
- culture discontinue alimentée (« fed-batch ») : des substances sont ajoutées au cours de la fermentation ;
- culture continue : le milieu de culture est renouvelé (turbidostat, chémostat).
Conditions de croissance
Substrats utilisés
Facteurs physico-chimiques
L'électrode de Clark comporte une cathode en platine et une anode en argent plongeant dans un électrolyte. L'ensemble électrodes - électrolyte est séparé du milieu étudié par une membrane perméable au dioxygène mais imperméable à l'eau et aux ions. Une tension de polarisation d'environ 0,7 V est appliquée entre les deux électrodes. Le dioxygène diffusant à travers la membrane est réduit en eau par les électrons libérés à la cathode et le courant qui s'établit entre les deux électrodes est proportionnel à la concentration en dioxygène dans l'électrolyte et donc dans le milieu. Le très faible courant produit est amplifié et converti en une tension proportionnelle à la concentration en dioxygène. Toutefois, la concentration de l'électrolyte en dioxygène dépendant non seulement de la concentration du milieu mais aussi de sa vitesse de diffusion à travers la membrane, elle est influencée par les facteurs externes tels que la température, la pression et la concentration en sels. Ceci rend nécessaire une correction des mesures, effectuée automatiquement par certains appareils. L'étalonnage est une opération indispensable qui doit être répétée avant chaque série de mesures.
Le réglage du zéro se fait en trempant l'électrode dans une solution de dithionite de sodium (S2O4Na 2), celle du 100 % de saturation dans de l'eau distillée saturée en dioxygène dissous après un rinçage soigneux de l'électrodeDifférents types de production de métabolites
Métabolites primaires
Les métabolites primaires sont des composés associés aux synthèses cellulaires généralement produits pendant la phase de croissanceLes cellules accumulent rarement un précurseur biochimique particulier : la synthèse est adaptée aux besoins suscités par la croissance. La sélection de mutants qui ont perdu la capacité de contrôler la synthèse d’un produit donné permet la production en excès de ce composé.
Métabolites secondaires : antibiotiques
Les métabolites secondaires sont produits habituellement après la phase de croissance : ils n’ont pas de relation directe avec la synthèse de matières cellulaires.
Bioconversions
Différents microorganismes peuvent réaliser des modifications mineures de composés normalement inutilisés lors de la croissance. Les enzymes des microorganismes réalisent des réactions très spécifiques dans des conditions « douces », contrairement aux méthodes chimiques. Les bioconversions d’antibiotiques (tableau ci-dessous) et de stéroïdes sont les plus courantes - Topic 2This topic
Topic 2
ANTIBIOTIQUES et ACTiNOBACTERIES
1)) MICROORGANISMES PRODUCTEURS D’ANTIBIOTIQUES
Les antibiotiques sont des métabolites secondaires qui peuvent être produits par les plantes supérieures,, les animaux,, les algues,, les lichens
Mais on peut considérer que 80 % de ces antibiotiques sont produit par les micro - organismes : bactéries et champignons..
Parmi les microorganismes : les BACTERIES en produisent : 80 % des antibiotiques et les CHAMPIGNONS : 20 %
Parmi les bactéries,, LES ACTINOBACTERIES (eex actinomycètes)) représentent70 %,, Ce sont les bactéries Gram++ à CG % élevé Supérieur à 55 %..
la majorité des antibiotiques de ce groupe sont synthétisés par le genre STREPTOMYCES qui sont les plus nombreux dans la nature..
Les bactéri es autres que les actinomycètes représentent 10 %
Ce sont les bactéries Gram++ à CG % faible
Ils sont représentés essentiellement par les familles
BACILLACEAE avec le genre bacillus qui synthétise l’essentiel des antibiotiques de ce groupe
Parmi les Les Gram – on peut citer la famille des PSEUDOMONACEAE : Le genre pseudomonas produit à lui seul une centaine d’antibiotiques..
Parmi Les champignons :
environ 2000 espèces sur les 20000 décrites sont productrices d’antibiotiques,, la plupart sont des a scomycétes : Aspergillus,, Fusarium,, Penicillium,, Trichoderma
2)) GENERALITES SUR LES ACTINOBACTERIES
Ce sont des organismes d’importance industrielle
70 % des molécules antibiotiques d’origine microbienne sont synthétisées par les actinobactéries
Les actinobactéries sont GRAM + , hétérotrophes,, aérobies,, mésophiles
Leur structure subcellulaire est procaryote mais certains genres,, leur morphologie est semblable à celle des moisissures.. Ils présentent des filaments mycéliens mais de composition comparab le à celui des bactéries
Ils forment des spores de dissémination (eexospores)),, ils sont sensibles aux antibiotiques et aux bactériophages,, résistants aux antifongiques et n’ont pas de stérols dans leur membrane
Anciennement dans la systématique des PROCA RYOTES ils étaient classés dans la Division des FIRMICUTES Classe des THALLOBACTERIA
Aujourd’hui grâce aux critères moléculaires ils sont classés dans le phylum des Bactéries Gram++ à CG%% élevé
Certaines actinobactéries peuvent être identifiées uniqueme nt par leur morphologie particulière,, la micromorphologie pour d’autres ,lla composition en acides aminés,, sucres ,llipides est obligatoire
Critères morphologiques :
Présence ou absence de mycelium aérien ( sa couleur,, sporulation,, fragmentation,, ...
Le my celium du substrat (ffragmentation,, stérile ou sporulé,, présence de sporanges
Les pigments solubles
Critères chimiques
Les chimiotypes sont définis selon les acides aminés pariétaux ,lles sucres pariétaux et les lipides cellulaires et les acides nucléiques
Acides aminés
La paroi des actinobactéries est composée de dipéptides qui peuvent contenir les acides aminés suivants
Acide diaminopimélique forme LL,, DL ou meso
Lysine,, ornithine,, glycine ,aacide diaminobutyrique((DDab))
Sucres cellulaires :
Le s couples arabinose xylose sont caractéristiques des actinoplanes
La présence de madurose caractérise les maduromycetes
L’arabinose et galactose les nocardioformes …....
La combinaison du type d’acide aminé pariétal et du spectre des glucides permet un classement en types principaux 1,2,3,4
Les lipides :
La présence d’acides mycoliques est caractéristique de quelques actinobactéries seulement .CCe sont des molécules en forme de chaînes droites ou ramifiée ,ssaturées ou insaturées avec présence é ventuellement de groupes
Il existe des acides mycoliques à 80 C (MMycobacterium)) 50C (NNocardia)) 30 C (CCorynebacterium))
La composition en phospholipides est également un critère de différenciation de quelques groupes et sous groupes
Les acide nucléiques
Le s actinobactéries sont caractérisés par un coefficient de Chargaff (CC++ G %)) élevé (660 à 80 %))
Mycobacterium((660 à 70 %)),, Actinomyces (663 à 73)),, Nocardia (667 à 69)),, Streptomyces((669 à 76)) Micromonospora (771 à 73)) Actinoplanes ( 70 à 76))
Quelques formes et genres
Les Nocardioforme,, Les Actinoplanetes,, Les streptomycetes et genres apparentés , Maduromycetes , Thermomonospora et genres apparentés :
Saccharothrix ,GGlycomyces ,MMycobacterium etc....
3 ) ISOLEMENT ET SELECTION D’ACTINOBACTERIES PRODUCTEURS D’’ ANTIBIOTIQUES
Source : Milieux naturels ,ssol,, eaux riches pour les actinobactéries courants (SStreptomyces)) et milieux extrêmes pour les actinobactéries plus rares (aautres que streptomyces))
Milieux :
- D’Isolement : milieux sélectifs avec inhibiteur s fongiques (ccyclohexemide)) et inhibiteurs des autres bactéries (GGram - par exemple))
- De culture : il existe différents type de milieux pour cultiver les actinobactéries selon le but recherché :
- Détermination des caractères culturaux
- Etude des caractères morphologiques
- Production de mélanines
- Milieux de sporulation
- Production d’antibiotiques
Selection
Elle repose sur la technique des antagonismes qui utilise des germes cibles
Bactéries : Bacillus,, staphylocoques,, E .ccoli,,,, Klebsiella
Levures : Candida , Saccharomyces……
Moisissures : Aspergillus,, Mucor,, Fusarium....
a)) Mileux solides
Test des cylindres d’agar :
- Souches à tester ensemencées et incubées10j à 28 °CC
- Découper des cylindres de gélose de 6mm à l’endroit des colonies
- Déposer les sur un milieu préalablement ensemencé avec un germe cible
- Les zones d’inhibitions sont mesurées après 24 h d’incubation à la température appropriée du germe cible
Test de la double couche
Les souches sont ensemencées en touches en bordure d’une boite de pétri.. Après incubation (110 jours à 28 °CC)) Les cultures sont inoculées par 5 ml de milieu préalablement ensemencement avec un germe cible .AAprès 20 h d’incubation les diamètres des zones d’inhibition sont mesurés
Test des stries croisées
Les souches à tester son t ensemencés en raies et incubées . Après développement,, l’activité antimicrobienne de chaque souche vis à vis des germes cibles et réalisé en inoculant ces dernières en stries perpendiculaires à la souche test.. Les zones d’inhibition sont mesurés en mm ap rès incubation .
b)) MILIEU LIQUIDE
En fiole agitée le champ d’investigation est plus large puisqu’on peut tester par exemple plusieurs milieux,, la concentration de certains substrats et minéraux,, suivre la cinétique de production etc....
Par ailleurs l’activité peut être dans le surnageant ou dans les cellules ou le mycelium
Technique des disques : L’activité antimicrobienne des surnageants de culture est testée par la méthode des disques stériles de papier saturés avec 100 µl de surnagean t.. Après séchage les disques sont déposés à la surface du milieu gélosé préalablement ensemencé avec la souche cible..
Technique des puits : Le principe est le même,, seulement on creuse un puits dans l’agar et on y dépose 100 µl de surnageant
Dans les 2 ca s on mesure le diamètre des zones d’inhibition..
- Topic 3
Topic 3
LES PROTEINES D ORGANISME UNICELLULAIRES
( POU ) ou Single Cells Proteins
DEFINITION
Des 1950,, l’OMS pris conscience que les sources de protéines allait manquer dans le monde et une sorte de cahier des charges fut édicté pour la production de ce qui pourrait être de nouvelles sources de protéines pour la consommation humaine et animale
Ai nsi fut crée aux USA ( Massachusset institut of technology 5MIT)),, le terme de single Cells proteins (SSCP)) ou Protéines d’organisme unicellulaires pour unifier la dénomination de produits variables issus de levures,, bactéries , champignons filamenteux et al gues microscopiques..
LES BACTERIES
L’’ avantage des bactéries réside dans le taux de croissance élevé,, ils produisent de grandes quantités de protéines sulfatées,, ils pre sente le désavantage de d’avoir une petite taille cellulaire ce qui complique la mise e n œuvre des procèdes complexes et onéreux pour les étapes de purification et d’extraction..
Par ailleurs la teneur en Acide nucléiques ARN et ADN est importante ce qui écarte leur utilisation en alimentation humaine,, car peuvent engendrer la goutte
La go utte est due à une augmentation de l'acide urique (hhyper uricémie)) qui elle - même provient de la dégradation des aliments riches en bases puriques.. Cette hyper uricémie va se traduire,, dans certains cas,, par une crise de goutte qui correspond au dépôt de cr istaux d'acide urique : inflammation brutale et très douloureuse d'une articulation,, la plus communément touchée est celle du gros orteil .
LES LEVURES
Les levures sont pauvres en protéines sulfatées mais sont de bonnes sources de vitamines B,,EE,,DD et el les présentent de nombreux avantages par rapport aux bactéries : faible teneurs en acides nucléiques,, cellules plus grandes,, meilleur acceptation de la part du consommateur
LES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX
La production de protéines alimentaires à partir de s champignons multicellulaires est un concept Nouveau
L’avantage réside dans l’aptitude à produire des polysaccharides hydrolysables.. Les procédés de purification sont simplifiés par rapport à ceux des bactéries et des levures
LES MICROALGUES
Les micro al gues du type Spiruline sont communément en utilises en alimentation humaine,, leur protéine riche en lysine constituent un excellent complément aux céréales .LL’intérêt de ces micro algues est leur capacité à utiliser le C02 comme source de carbone et certai nes cyanophicées peuvent utiliser l azote atmosphérique
SELECTION DE SOUCHES
La sélection sera guidée par un certain nombre de principes :
Le substrat carboné : les POU sont considérées comme produits à grande échelle le prix de revient est relativement bas il faut choisir des substrats carbonés peu coûteux , bon marché et disponible en grande quantité
La source de carbone représente 50%% du p rix de revient de la protéine d’ou l’intérêt d’utiliser les sous produits de l’agriculture et l’agroindustrie : mêlasse,, lactosérum , déchets cellulosiques,, paille et dans les années 70 et 80 les hydrocarbures et le méthanol
Le choix portera également sur un certain nombre de paramètres qu’on peut classer :
Paramètres cinétiques ; taux de croissance,, rendement,, productivité
Paramètres physiologiques : thermophilie,, exigence en facteurs de croissance,, résistance aux phages,, utilisation de l’ammoniac comm e source d’azote
Paramètres de composition :%% élevé en protéines ,tteneur faible en lipides,, en Acides nucléiques et en lipides
Paramètres de traitabilité : Floculation,, facilité de lyse,,eextraction
Paramètres de toxicité : innocuité totale du produit
LES L EVURES LES BACTERIES
AVANTAGES
INCONVENIENTS
AVANTAGES
INCONVENIENTS
MO les plus anciennement connus
Rarement toxiques ou pathogène
Se développent à Ph acide sélectifs
Teneur élevée en lysine
Teneur acceptable en acides nucléiques
Facilité de récupération
Riches en vitamines du groupe B
Tx de croissance faible
Teneur en protéines < à celle de bactéries
Teneur en lipides élevé
Termophilie peu fréquente
Choix limité (nnbr d’espèces réduit))
Tx de croissance élevé
Teneur en lipides faibl e
Spectre d’acides aminés favorable
Thermophilie fréquente
Choix illimité
Mal connues et étudiées
Peu accepté )
Teneur en Acides nucléiques élevée
pH de culture rarement sélectif
Pb de récupération
Risque de Toxicité
Présence d’endotoxines,,aacides gras à nombre impairs de carbone
Nécessité d’études nutritionnelle et de toxicité
Les MYCOPROTEINES : Le QUORN
C’est l’un des rares survivants des programmes de POU des années 60 et qui connaît aujourdhui une véritable réussite ;
Le Quorn est un assemblage des filaments du mycélium de champignon avec des aromes pour imiter la viande et servir de source de protéine de substitution
Les produits Quorn sont lancés en Suisse en 1996
A partir de 1998,, il est lancé partout en Europe et aux états unis par l’intermédiaire de grandes sociétés alimentaires : Marlow Food
En 2004 , il est intégré dans la restauration des Mc Donalds en Angleterre
Tous ces produits ont comme ingrédient principal une mycoprotéine associée à différents mets (ppâtisseries , biscuits,, plats cuisinés …)) riche en protéines de qualité et tous les acides aminés essentiels . Elle contient peu de calories (rrégimes hypocaloriques)) et des fibres alimentaires essentielles pour le système digestif
La mycoprotéine est obtenue par cul ture d’un champignon du genre Fusarium de la division des Ascomycetes isolé en Angleterre à partir d’échantillon de sol
Fusarium graminearum
Fusarium Venenatum
Classe des sordariaceae,, Ordre des hypocréales,, famille des Nectriaceae
F . Venenatum est le nom de la forme ana morphe ou asexuelle les formes sexuelles peuvent être appelée différemment
La souche produit en effet 2 types de spores : des macro conidies qui sont la forme asexuée et des ascospores contenues dans des périthèces qui représen tent la forme sexuée
Les mycoprotéines sont obtenues par fermentation en bioréacteur agité (ccontinu ou discontinu)) à partir de mêlasse de betterave ou de canne ou de sirop de glucose obtenu par hydrolyse d’amidon . On y ajoute de l’ammoniac et des solutio ns minérales et des vitamines
Le milieu est stérilisé par un par un procédé continu ou discontinu
Après la fermentation le mout subit une étape de réduction du taux d’acides ribonucléiques qui donnent au produit un goût agréable
On utilise les propriétés de l’ARN ase cellulaire.. Les cellules subissent d’abord un choc thermique qui aboutit à une inactivation des protéases cellulaires.. la décomposition des ribosomes aboutissant à la libération des ARN et l’inactivation d’un inhibiteur thermosensible de l’Ar n ase
La biomasse à teneur réduite en ARN subit une filtration,, sur un tapis roulant sous vide obtient un gâteau de mycoprotéines qui va vers le conditionnement
LA SPIRULINE
Appelées Algues bleues puis cyanophycées , puis cyanobacteries ce sont des b actéries Elles sont caractérisés par la présence de la chlorophylle a et des pigments phycobillines.. Les espèces sont distinguées selon les caractères morphologiques généraux et leur reproduction..
Le CO2 est fixé au cours de la photosynthèse via la cycl e de Calvin..
La spiruline est un organisme microscopique,, pluricellulaire,, filamenteux,, mobile enroulée en spirale de 0,25 mm de long et 0,01 de diamètre
Sa reproduction asexuée s’effectue par division du filament elle comprend 3 espèces ( S platensis,, S.. j eejibai ) dont la plus connue est :
Spirulina maxima : cultivée et consommée par les mexicains depuis longtemps sous forme de purée verte.. Sa composition chimique :
6%% d’humidité
65%% de protéines dont 8 Acides aminés essentiels
15%% de glucides
6%% de lipi des dont de nombreux acides gras essentiels
Des vitamines du groupe B
Des pigments caroténoïdes (BB carotène ou provitamine A))
Elle est comestible et peut résoudre des problèmes de famine dans le monde
Elle est séchée,, broyée ou pulvérisée et présente l’as pect d’une poudre fine de couleur bleue vert foncée d’odeur et de goût agréable.. L’acide gamma
linolénique représente 10 à 20 % du total des acides gras soit 1 à 2 % de la matière sèche
La spiruline peut être produite d’une manière artisanale dans des bass ins d’eau douce essentiellement ( fermes aquacoles ) qui existent de part le monde mais aussi en milieu marin ou en eau salée .
Le CO2 dissout dans l’eau n’étant pas suffisant,, on effectue des barbotages de CO2 dans le bassin de culture,, Les spirulines son t constituée de 47%% de carbone..
L’eau est enrichi avec des minéraux dont le phosphore,, indispensable à la photosynthèse (AATP,, NADP)) sous forme de phosphate dipotassique K2HPO4 ou phosphate trisodique NA3PO4
L’Azote,, les sources d’azote préférées de la spiruline sont l’ammoniac,, l’urée,, on utilise aussi les nitrates
Mais on peut cultiver également les spirulines en association avec des cyanobactéries fixatrices d’azote (AAnabena,, Calothrix,, Nostoc……..))
le pot assium , le fer et le magnésium sont également apportés dans le milieu
Le oh de la culture est maintenu entre 8 et 11
La température doit être supérieure à 20 °CC .lla vitesse maximale de croissance est entre 35 et 37°°CC au de la il y ‘aa risque de destructio n des spirulines
Dans ces conditions optimales une forte luminosité est necessaire
Toutefois une forte lumière peut être dangereuse dans certains cas
(CCulture froide 14,, 15 °CC ou culture chaude > 40°°CC car il y ’aa un échauffement photonique supplémentaire
Culture diluée ou culture en difficulté
L’agitation est nécessaire pour une dispersion homogène de la spiruline,, mais une agitation trop violente fragmente et endommage les filaments
- Topic 4
Topic 4
CONSERVATION DES SOUCHES INDUSTRIELLES
a)) Repiquages successifs
C’est la méthode la plus courante en laboratoire , on effectue des repiquages réguliers sur gélose inclinée ou en bouillon..
- Incubation aux températures optimales de croissance
- stockage à des températures basse ( 4 à 10 °))
La fréquence des repiquages dépend de la nature e la souche et de ses conditions de croissance
- Repiquage journalier ou hebdomadaire des souches les plus fragiles
- Repiquage bi ou tri annuels pour la majorité de s bactéries ,ddes streptomycètes et sporulés
Les risques du repiquage :
- contaminations
- Perte de caractères et apparition de caractères nouveaux par mutations
- Chute de viabilité
Ces risques augmentent avec le nombre de repiquages ,eex cas de Strepto myces erythreus mutant producteur d’erythromycine,, des le 4 ième repiquage 50 % des colonies ne sporulent plus et ne produisent que que 3 % de la quantité normale d’’ ATB donc le repiquage successif est à éviter dans ce cas :
Toutefois cette méthode peut êt re améliorée en utilisant des milieux et des conditions de culture qui maintiennent les spores dans un état de métabolisme réduit ou les protège contre la déshydratation en utilisant des milieux pauvres (tterre)) ,iimmersion sous huile minérale (hhuile de pa raffine))
* Culture sur gélose à l’extrait de terre en culot
On prépare une gélose molle à l’extrait de terre :11 kg de terre dans 2 litres d’eau stérilisées 1 h à 30 °cc et filtrée que l’on ensemence par une piqûre centrale.. Dés que les cultures commencent à se développer les tubes sont conservés à +44°°CC
*)) Stabilisation sur terre
Applicable au so uches sporulées ( Pénicillium,, Aspergillus,, B acillus,, Streptomyces))
D’abord il faut préparer une suspension de spores en utilisant des milieux spéciaux
Puis préparer un mélange de 20 % terre , 78 % de sable,, 2%% de carbonate de calcium à et répartir dans des tubes à rais on de quelques grammes et stériliser 8 à 15 heures à 130 °cc
Après refroidissement on ajoute quelques gouttes de la suspension de spores , on évapore l’excès d’eau dans un dessiccateur sous vide . les tubes sont scellés et se conservent plusieurs années san s germer à température ordinaire
b)) Congélation
La réussite de la congélation est liée à la température de congélation,, vitesse de refroidissement , la présence d’un cryoprotecteur,, la température de stockage et la décongélation
Au cours de la congélation peut se former des cristaux de glace intra et extracellulaire qui peuvent désorganiser les membranes et les parois cellulaires ce qui entraîne la mort des cellules d’ou donc nécessité de l’addition d’un cryoprotecteur tel que :
Dimethylsulfoxyde (DDMSO)) , glycérol,, (ppénètrent dans la cellule))
Polyéthylènes glycol (PPEG)),, polyéthylènes pyrolidone (PPVD)) ne pénètrent pas dans la cellule
Protéines du sang,, sérum , lait
c)) Lyophilisation
C’est une technique très utilisée efficace et économique pour conserver les spores pendant des durées très longues (330 ans))
Le principe consiste en une déshydratation d’une suspension congelée de micro - organismes par sublimation sous pression réduite .LL’eau est évaporée passe de l’état solide à l’é tat gazeux sans passer par l’état liquide.. Les cellules lyophilisées peuvent être conservées très longtemps si elles sont protégées de l’o2 de l’humidité et de la lumière
Au cours de la lyophilisation les spores sont soumises à des variations extrêmes d’en vironnement (ccongélation,, dessiccation )qqui vont entraîner des altérations cellulaires variées d’ou donc le contrôle des propriétés des souches lyophilisées
est indispensable car elles peuvent perdre certaines propriétés après lyophilisation
Conditions de réussite de la lyophilisation : l’âge de la culture est important,, les cellules doivent être jeunes et la croissance se situe entre la fin de la phase logarithmique et le début de la phase stationnaire
Les agents protecteurs peuvent être ajo utés au milieu de lyophilisation et il doivent avoir les propriétés suivantes :
- Caractère hydrophile pour empêcher la dessiccation totale qui dénature le DNA
- Inertie totale : les substances utilisées : lait écrémé et albumine du sérum
ENSEMENCEMENT : LES INOCULA INDUSTRIELS
(CCas particulier des champignons filamenteux , inoculum sporal )
Au laboratoire ou en milieu industriel le principe de l’inoculation est toujours le même :
Il faut ensemencer largement le milieu afin que la souche se développe suffisamment pour supplanter les contaminations éventuelles
A chaque stade,, il faut surveiller les contaminations , les bactériophages et les mutations qui sont des causes de la baisse des ren dements
Pour réussir une production microbiologique,, le matériel vivant doit répondre aux exigences suivantes :
Qualité :
La culture doit posséder une capacité maximale de production.. Des tests de stérilité servent à détecter la présence éventuelle de con taminants à tous les stades de la préparation des inocula (iinoculum sporal , précultures ,cculture principale))..
Des prélèvement sont étalés sur des milieux gélosés ou inoculés en milieux liquide propices au développement des divers groupes de micro - organis mes.. Cette analyse est complétée par un examen microscopique..
Quantité :
Les cellules ou les spores puis les cultures de propagation doivent être en quantité suffisante pour permettre une inoculation optimale de la culture suivante..
La quantité de matér iel d’inoculation des précultures et des cultures principales peut influer spectaculairement sur les caractères morphologiques des cultures et sur leur productivité.. Pour chaque souche et chaque procédé la quantité optimale d’inoculum pour les différents stades doit être déterminée..
Axénie : la souche choisie ne doit pas être contaminée tout au long du procédé de fabrication par d’autres micro - organismes
Culture en Milieu solide
Ces milieux sont répartis dans des tubes à essai ou dans des bouteilles de Roux.. C’est le procédé habituel pour la reprise de croissance des souches et l’analyse des populations ainsi que pour la détection des contaminants..
Parmi les milieux gélosés favorables au développement de nombreux champignons,, il est possible de citer les milieux suivant : Milieu extrait de malt
et de levure ; milieu aux flocons de pomme de terre - glucose : milieu peptone - glucose ,
Les milieux au céréales ( riz , avoine , millet ou orge perlé)) : présentent une surface totale nettement supérieure à celle des milieux gélosés avec une formation de spores par unité de surface du même ordre de grandeur .
Les grains sont légèrement humidifiés avec une solution nutritive favorisant la sporulation .AAprès stérilisation (445 minutes à 121 °CC)),, ces grains sont séparés par agitation manuelle puis inoculés avec une suspension des spores préparés dans le milieu de sporulation..
Après incubation les spores sont récupérées par addition d’un milieu de protection et agitation intense .
Culture en Milieux liquides :
C’est la méthode idéale pour obtenir des inocula de grand volume facile à manipuler.. Cependant,, beaucoup de champignons ne sporulent pas aisément en cultures liquides agitées..
Le milieu sorbose - tryptone se révèle favorable à la sporulation de nomb reux champignons . Sa formule est la suivante : sorbose,, 50 grs ; tryptone (bbacto)),, 5 grs ; KH2PO4,, 0.25 grs ; MgSO4,, 7 H2O , 0.25 grs ; Ca((NNO3))22,4 H2O , 0.25 grs ; KCl , 0.125 grs ; traces de Fe , Zn , Mn ; eau , amener à 1000 ml ; pH 6.2 - 6.5..
Les spor es sont récupérées par filtration sur laine de verre , puis centrifugées.. Elles sont ensuite mises en suspension dans un milieu de protection et conservées à basse température..
Inoculum Végétatif : (ppré culture , culture de propagation ,ppied de cuve))
Avec l’inoculum sporal sont inoculés , en Erlenmeyers , puis en bioréacteurs des milieux de propagation permettant une germination rapide des spores et une croissance intense des hyphes .
Les concentrations en nutriments peuvent être progressivement augme ntées.. Des milieux de propagation de composition qualitative proche du milieu de production permettant de réduire la phase de latence , et donc de diminuer les temps d’incubation..
Généralement les milieux de propagation contiennent des substrats naturels ( extraits de malt,, extraits de levure,, peptone , caséine …)).. Voici un exemple de ce type de milieux :
- Extraits de malt liquide , 20 grs ; extraits de levure , 4 grs ; KH2PO4 , 0.5 grs ; MgSO4,, 7H2O,, 0.2 grs ; eau , amener à 1000 ml ; pH , 5.8 .
Le type de milieu de propagation , les conditions d’incubation et sa durée influent sur les taux de production obtenus dans la culture principale.. Pour éviter des retards de production dus à des « accidents » , les cultures de propagation de faible volume sont souven t dédoublées..
RECAPITULATIF
On réalise une suspension de spores que l’on dilue et que l’on repique à la surface d’un tube gélosé inclinée .PPuis on fait un preinoculum dans un milieu liquide en fioles Erlen meyers ou Fernbach incubés sur de agi tateurs rotatifs.. Il est indispensable que le milieu choisi donne une grande quantité de spores par fragmentation du mycélium .OOn passe ensuite à l’atelier dans un petit fermenteur de 300 à 500l puis dans un fermenteur plus grand (ggerminateur)) de 3000 à 5 000l qui sert de pied de cuve
Grace à un récipient métallique mobile dénommé bazooka on ensemence aseptiquement le fermenteur à l’aide d’air comprimé stérile dont la pression chasse le contenu du récipient dans le fermenteur
Toute la tuyauterie est stérilisée par la vapeur..
- Topic 5
Topic 5
LES ENZYMES INDUSTRIELLES
Pour séle ctionner une souche productrice d’enzymes en vue d’une production industrielle ; il faut définir au moins 3 paramètres ;
Définir le type d’enzyme recherchée et ses caractéristiques
Choisir le type de microorganisme
Mise en œuvre des techniques d’isolement et de sélection en fonction des critères choisis , Cette dernière comprend
Le choix des milieux naturels et la source d’isolement
Choix des milieux d’isolement en milieu solide : milieux sélectifs et de milie ux de production en milieu liquide
Mise en évidence des activités enzymatiques en milieu solide et en milieu liquide
1)) Les ENZYMES INDUSTRIELLES et leurs APPLICATIONS
Ce sont en général des hydrolases classées par famille s selon le type de produit à dég rader glucides protéines et lipides
Famille des glucides : les enzymes industrielles les plus connues sont
les amylases a et b ,lles glucose isomérase s , les glucomylases,, les pullulanases …
Ces enzymes sont utilisée s dans les procèdes amidonniers pour l a liquéfaction de l’amidon pour la production de sucres liquides,, mais également dans les détergents pour éliminer les impuretés à base d’amidon etc ….. Tels que les
cellulases,, les xylanases,, Les lactases,, l’invertase …..
Les M..OO producteurs quelques exe mples :
Amylases a et b produites par Bacillus licheniformis , elle sont relativement stable s à 6o°°cc ais il e x iste des amylases plus stables et thermorésistantes produites par des MO hyperthermophiles notamment par les Archeae tel que
Pyrococcus furiosis qui ré siste à 100 °CC
Les amylases sont également produit e par des moisissures du genre A spergillus et des actinomycetes ( streptomyces))
Cellulases :
Les cellulases sont utilisée s dans les industries agroalimentaires dans la clarification d es jus et da ns la composition des détergents pour le nettoyage et la clarification des couleurs,, elles empêche nt le ternissement des couleurs et
a méliore nt la douceur des tissus en coton
Dans l’alimentation du bétail elles servent à pré digérer la cellulose
Les Mo producteurs s ont essentiellement les moisissures tel que Aspergillus niger
Xylanases : catalyse les polymères de xylane à base de xylose (ppentoses)) présent s dans les hemicelluloses
Elle est utilisée en papeterie et augmente l’accès des produits chimiqu es de blanchiment aux fibres de la pâte en éliminant le xylane
Les xylanases sont produites par les champignons et les bactéries
Bacillus subtilis , Aspergillus terreus
Lactases (BB galactosidase))
Utilisée en alimentation humaine pour améliorer la digestibi lité du lai t , fromage , yaourt ( intolérance au lactose))
Elle est produite industriellement par les levures du genre Kluyveromyces
K.. lactis et K fragilis sur des substrats à base de lactoserum
Les protéases
On les différencie en fonction de leur pH d’activ ité , protéases alcaline,, acide et neutres et de la température.. Protéases thermostables
Les protéases industrielles sont utilisées en industrie agroaliment aire ( présure)) , en industrie des détergents et en tannerie (ccuir et peau))
La présure : un grand n ombre d’enzymes protéolytiques ont les propriétés de coaguler le lait . Les plus utilisées sont le s protéases d’origine animale ( mélange de chymosine et de pepsine ) mais elles sont de plus en plus remplacées par les protéases d’origine microbiennes tel que celle s e x traite s de Mucor miehei
Actuellement la présure est produite par génie génétique sur E coli modifiée portant l’information génétique de la chymosine prélevée dans les cellules de l’estomac de veau
Les protéases utilisées dans les détergents , éli minent les impuretés protéiques,, elles sont les composants essentiels des détergents modernes , elles sont utilisées à de faibles concentrations et évitent les températures de lavage élevées
Les protéases thermostables sont isolées à partir isolées à par tir des MO hyperthermophiles
Les MO producteurs Bacillus licheniformis Bacillus subtilis Bac illus A myloliquefaciens
Elles sont également d’origine fongiques ou d’archeae ( Pyrococcus))
Les lipases
Elles catalysent l’hydrolyse des triglycérides dans les détergents , elles sont utilisées pour éliminer les taches de graisse présentes dans les tiss us mais leur efficacité est lim itée dans les détergents en raison de leur faible stabilité dans les milieux dénaturants (pph éle vés et presence de métaux lourds....))
Elles sont produites essentiellement pa r les champignons filamenteux tel que
Aspergillus oryzae m ais aussi par des bactéries du genre pseudomonas
Aut r es enzymes
Penicilline amidase ;
Utilisée dans la fabrication de pénicillines semi synthétiques , elle l ibère l’acide aminopenicillanique
Origine Ecoli : intracellulaire
Bacillus megaterieum : extracellulaire
Taq polymerase (ttaq pol))
ADN polymérase thermorésistant extraite de la bactérie Thermus aquaticus , sa température d’action est 72 °CC
Règne bacteria , division deinococcus,, thermus
Classe dinococci,, ordre thermales
2)) TECHNIQUES D’ISOLEMENT DES SOUCHES PRODUCTRICES D’ENZYMES
Choix des milieux d’isolement
Les M O sont abondants et localisés là ou les substances à hydrolyser sont abondantes ; on cibler a également les milieux possédant certaines propriétés recherchées pour les enz ymes (ttempérature ,PPh))
ex les hyperthermophiles , il faut les re chercher dans le sources thermales , les microorganismes halophiles dans les milieux salés
Les cellulases,, les xylanases,, les pectinases : il faut les rechercher dans les sols forestiers riches en débris végétaux
Les lactases,, on va les rechercher dans les milieux ou le lactose est présent ( lait et produits laitiers)) et souvent les enzymes sont induites par la pr ésence de leur substrat
Les méthodes classiques d’isolement utilisent des milieux sélectifs selon le type de Mo recherché ; levure s , moisissures,, bactérie s Gram++ , Gram - , contenant le substrat de l’enzyme comme seule source de carbone
Ex ; sélection de Ba cillus producteur de xylanases thermostable s
On utilisera un milieu gélosé à base de xylane , un antifongique (ccyclohexemide)) pour éliminer l es champignons envahissant et un antibactéri en ou un colorant anti Gram++,, pH 7 . On incube à 50 °cc
Sélection de As pergillus producteur de lipases
On utilisera un milieu à base trioleine et un antibactérien à large spectre (ooxytetracycline ou streptomycine ) pH 5
L’isolement des hyperthermophiles nécessite l’utilisation de Gel rite à la place d l’agar pour incuber à 70 °CC
Mise en évidence des activités enzymatiques
Le principe consiste à mettre la souche ou l’extrait enzymatique produit par la souche en présence de son substrat spécifique et de mettre en évidence le produit de la dégradation par des techniques
Chimiques et biochimiques , Spectroscopiques ou chromatographique
Les méthodes peuvent être simplifiées pour des raisons de rapidité et de gain de temps (mminiaturisation , coloration , galeries))
La souche e s t généralement purifiée après isolement puis co nservées soit par repiquages successifs soit par congélation en présence d’un cryoprotecteur
Préparation de l’extrait enzymatique
On réalise des cultures dans 25 ml de milieu contenant le substrat de l’enzyme comme source de carbone et inducteur de l’enz yme
On arrête la culture vers la fin de la phase exponentielle de croissance
Le surnageant est obtenu par centrifugation de la culture à 1200 rpm pendant 10mn dans une centrifugeuse réfrigérée à 4°°cc ; ils sont ensuite stérilisés sur filtre de 0,22 µ pui s stockés dans des tubes Eppendorf à des températures de - 20°°cc.. Chaque tube contient environ 1,5ml d’extrait qui serviront pour les tests enzymatiques
Technique
L’activité enzymatique est réalisée soit sur milieu solide ou milieu liquide
En Milieu solid e
C’est La technique de diffusion sur agar est souvent utilisé notamment pour les champignons filamenteux qui ont un équipement enzymatique très important et exo cellulaire
Les souches sont déposées directement en spot soit leur extrait enzymatique sue gé loses contenant le substrat à hydrolyser
Des observations sont effectuées après l’incubation selon les réactions prévues dans le milieu gélosé
Lorsque on utilise l’extrait enzymatique au lieu de la souche , on applique la technique des cup plates . Dans la gélose contenant le substrat on creuse de s puits de 4mm , 4 par boite , on les remplit avec 100 µl de la solution enzymatique et sont incubées à température appropriée
Les activités enzymatiques apparaissent sous forme de zones claires autour de la s ouche ou du puit .
La taille du halo peut être in indicateur de mesure de l’activité enzymatique puisqu’il est proportionnel à l’activité.. Le résultat est exprimé par le calcul du rapport taille du halo /ttaille de la colonie
Mesure de l’activité e n mi lieu liquide
Dans ce cas la réaction enzymatique est réalisée en milieu liquide en tube ou en fiole , on utilise généralement l’extrait enzymatique et on mesure les produits de l’hydrolyse par les techniques appropriées
A ctivité lipasique : substrat : tri oleine
L’activité est déterminée par mesure de l’acidité par titration acide base des acides gras libres